人CD2相關(guān)蛋白剪接異構(gòu)體啟動子區(qū)的克隆及microRNA-548k對其調(diào)控機制的研究.pdf

1、目的:克隆人CD2相關(guān)蛋白剪接異構(gòu)體(CD2AP002)啟動子區(qū)，探討microRNA-548k(miR-548k)能否通過靶向結(jié)合該剪接異構(gòu)體啟動子序列參與其轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　方法:采用PCR方法獲取CD2AP002基因5'側(cè)翼序列及一系列5'端缺失體，定向插入到pGL3-Basic載體中，雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)鑒定其啟動子活性;RegRNA2.0在線軟件預(yù)測CD2AP002啟動子區(qū)域潛在的miR-548k的結(jié)合位點;熒光原位

2、雜交實驗(FISH)檢測miR-548k在HEK293細胞內(nèi)的定位，細胞免疫熒光實驗(IF)觀察RNA干擾蛋白(AGO2)在HEK293細胞內(nèi)的分布;利用點突變/缺失突變技術(shù)、miR-548k模擬劑(miR-548k mimic)/miR-548k抑制劑(miR-548k inhibitor)的轉(zhuǎn)染、實時定量PCR(Real time quantitative PCR)技術(shù)，鑒定miR-548k是否能通過靶向CD2AP002啟動子的潛在

3、結(jié)合位點調(diào)控CD2AP002的轉(zhuǎn)錄;轉(zhuǎn)染miR-548k模擬劑(miR-548k mimic)后，染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)檢測RNA聚合酶Ⅱ在人CD2AP002啟動子區(qū)域的富集情況。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建有活性的人CD2AP002質(zhì)粒;通過生物信息學預(yù)測，在CD2AP002啟動子區(qū)域含有兩個miR-548k靶向結(jié)合位點;FISH證實miR-548k可見于HEK293細胞核、IF證實AGO2蛋白在HEK293細胞的胞核里有分布;mi