藏丹參與紫花丹參中丹參酮和丹酚酸代謝差異研究.pdf

1、紫花丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)是一種藥用模式植物，廣泛用于治療心血管疾病。藏丹參（Salvia castanea Diels f.tomentosa Stib）與紫花丹參有著相似的藥理作用，作為一種地方習(xí)俗用藥替代丹參使用。藏丹參和紫花丹參積累不同水平的天然產(chǎn)物，如丹參酮和丹酚酸，但其分子機制尚不明確。本研究通過對比正常培養(yǎng)條件和不同誘導(dǎo)條件下藏丹參與紫花丹參毛狀根的次生代謝差異，揭示兩種丹參毛狀根的次生

2、代謝物積累差異以及它們對生物脅迫、非生物脅迫和信號分子的差異響應(yīng)。這為研究藏丹參和紫花丹參次生代謝差異提供初步的基礎(chǔ)，也為植物組織工程提供有利的參考。此外，對比兩種丹參中參與多個代謝途徑的關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平，篩選得到一些參與特定代謝的候選基因，為進一步研究其功能提供基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴對正常培養(yǎng)條件下藏丹參和紫花丹參毛狀根中次生代謝物進行高效液相分析，結(jié)果表明藏丹參比紫花丹參產(chǎn)生更高水平的隱丹參酮(CT)、丹參酮ⅡA

3、(T-ⅡA)、咖啡酸(CA)和迷迭香酸(RA)，而產(chǎn)生更低水平的二氫丹參酮Ⅰ(DT-Ⅰ)和丹酚酸B(SAB)。⑵應(yīng)用水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate，LH)誘導(dǎo)紫花丹參和藏丹參毛狀根，先進行LH濃度優(yōu)化，再進行時間梯度實驗。LH濃度篩選結(jié)果表明1g/LLH可以作為一種優(yōu)化濃度的誘導(dǎo)子，既有利于兩種丹參毛狀根生長，又促進丹參酮積累。LH誘導(dǎo)的時間梯度實驗表明1 g/LLH誘導(dǎo)對兩種丹參的丹參酮生物合成有一定的促進

4、作用，而對丹酚酸積累影響較小。此外，與紫花丹參相比，1g/LLH更有利于藏丹參中丹參酮的積累，藏丹參中DT-Ⅰ、CT、丹參酮Ⅰ(T-Ⅰ)和T-ⅡA積累在誘導(dǎo)后第9d達到最高水平，分別是對照組的2.00倍、3.55倍、3.91倍和1.24倍。與紫花丹參相比，LH誘導(dǎo)藏丹參中HMGR、DXR、GGPPS和CYP76AH1更持久的上調(diào)，可能導(dǎo)致藏丹參產(chǎn)生更強烈的丹參酮代謝響應(yīng)。⑶為了揭示藏丹參和紫花丹參毛狀根對生物和非生物誘導(dǎo)子的差異響應(yīng)，使

5、用酵母提取物(YE)、Ag+和茉莉酸甲酯(MJ)分別誘導(dǎo)藏丹參和紫花丹參毛狀根。YE可以誘導(dǎo)紫花丹參中DT-Ⅰ、CT、CA和RA產(chǎn)生，而顯著促進藏丹參中DT-Ⅰ、CT、T-Ⅰ、T-ⅡA和CA的積累;Ag+在特定時間誘導(dǎo)紫花丹參中CT、T-Ⅰ、T-ⅡA、CA和RA的產(chǎn)生，而增加藏丹參中CT、T-ⅡA、RA和SAB積累;MJ顯著促進藏丹參中DT-Ⅰ、CT、T-ⅡA、CA、RA和SAB積累，而僅僅影響紫花丹參中DT-Ⅰ、CT、CA和SAB的產(chǎn)

6、生。基因表達分析表明兩種丹參中關(guān)鍵基因?qū)φT導(dǎo)子的差異響應(yīng)可能導(dǎo)致兩者產(chǎn)生不同的丹參酮和丹酚酸代謝響應(yīng)。⑷為了篩選藏丹參和紫花丹參次生代謝相關(guān)的一些候選基因，對藏丹參和紫花丹參毛狀根中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平進行比較。結(jié)果表明在萜類化合物生物合成途徑中，有10個基因在藏丹參中高表達，而31個基因在紫花丹參中高表達。在酚酸類化合物生物合成途徑中，有6個基因在藏丹參中高表達，而11個基因在紫花丹參中高表達。細胞色素P450中有12個基因在藏丹參中高

7、表達，而另有12個基因在紫花丹參中高表達。轉(zhuǎn)錄因子中有3個基因在藏丹參中高表達，而1個基因在紫花丹參中高表達。⑸組織特異性表達分析表明CYP71AT90、CYP94C55、CYP82V2、CYP749A39、CYP721A38、CYP76AK3和ORA1在丹參的根中高表達，而CYP736A123和CYP716A89在丹參的葉中高表達。此外，使用Gateway技術(shù)構(gòu)建了丹參SmCYP749A39、SmCYP71AT90和SmWRKY61的