SCL轉(zhuǎn)基因聯(lián)合SCF促Cajal間質(zhì)細胞恢復的在體實驗研究.pdf

1、背景： Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal．ICC)是胃腸道的起搏細胞，具有產(chǎn)生、傳播慢波的功能，參與調(diào)控腸神經(jīng)信號傳導?，F(xiàn)已證明慢傳輸性便秘等眾多胃腸動力紊亂性疾病都存在ICC數(shù)目減少。新近的研究提示ICC發(fā)生平滑肌細胞樣表型轉(zhuǎn)化(而非凋亡)可能是眾多胃腸動力紊亂性疾病ICC減少的共同機制。 ICC細胞膜特異性表達酪氨酸激酶受體(c-kit)，與其配體干細胞因子(stem cel

2、lfactor，SCF)結(jié)合后所啟動的SCF/c-kit信號通路，對ICC發(fā)育、分化及胃腸道節(jié)律性活動的穩(wěn)定至關重要。干細胞白血病(stem cell leukemia，SCL)基因編碼螺旋-環(huán)-螺旋類轉(zhuǎn)錄因子，是c-kit上游的重要調(diào)控基因，通過作用c-kit基因啟動子調(diào)節(jié)c-kit表達來發(fā)揮其“生存基因”的功能，具有強烈的促c-kit表達作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)SCL，基因可以在細胞以及組織培養(yǎng)條件下上調(diào)c-kit表達，聯(lián)合SC

3、F應用，恢復SCF/c-kit信號通路，促進ICC平滑肌細胞樣表型逆轉(zhuǎn)恢復。因此推測在體SCL轉(zhuǎn)基因亦可通過上調(diào)c-kit表達，聯(lián)合SCF應用，恢復SCF/c-kit信號通路，促進ICC平滑肌細胞樣表型逆轉(zhuǎn)恢復。為此，本研究構(gòu)建表達SCL基因的重組腺病毒Ad-SCL，聯(lián)合應用SCF，在體探討SCL轉(zhuǎn)基因聯(lián)合SCF對Cajal間質(zhì)細胞恢復的影響及機制。為今后深入探討促ICC恢復及其機制奠定基礎。 目的： 1．快速構(gòu)建并鑒定

4、含有人SCL，基因的重組腺病毒Ad-SCL； 2．細胞及在體水平觀察重組腺病毒Ad-SCL，轉(zhuǎn)染效率及生物安全性； 3．觀察重組腺病毒Ad-SCL聯(lián)合SCF應用對ICC恢復的作用。 方法： 1．采用亞克隆技術將人SCL基因片斷定向克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上，獲得重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV/SCL。Pme Ⅰ線性化后轉(zhuǎn)化包含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183菌。同源重組

5、后篩選陽性克隆，用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染293細胞，綠色熒光蛋白觀察以及PCR鑒定獲得的重組腺病毒Ad-SCL。 2．用不同MOI的重組腺病毒Ad-SCL轉(zhuǎn)染Hela細胞株，確定最佳病毒轉(zhuǎn)染MOI；用最佳MOI的重組腺病毒Ad-SCL轉(zhuǎn)染Hela細胞株，用MTT細胞增殖實驗觀察對Hela細胞生長的影響；用RT-PCR法檢測重組腺病毒Ad-SCL介導的SCLmRNA在Hela細胞以及體外培養(yǎng)的ICC中的表達；經(jīng)ICC缺失模型Bal

6、b/c小鼠尾靜脈注射1.6×10<'9>PFU的重組腺病毒Ad-SCL，在不同的時相點(2d、7d、15d、30d)檢測重組腺病毒在小鼠心、肺、肝、脾、腎、小腸及大腸組織內(nèi)的分布和表達；HE染色法觀察重組腺病毒的體內(nèi)毒性；RT-PCR法分析重組腺病毒介導的SCL mRNA在各臟器內(nèi)的表達。 3．取ICC缺失模型Balb/c小鼠，經(jīng)尾靜脈注射1.6×10<'9> PFU的重組腺病毒Ad-SCL，Western Blot檢測注射后2

7、d、7d、15d、30d結(jié)腸肌條c-kit蛋白的表達；取ICC缺失模型Balb/c小鼠，經(jīng)尾靜脈注射1.6×10<'9>PFU的重組腺病毒Ad-SCL以及SCF(30μg/kg，連續(xù)腹腔注射5d)后7d、14d、21d、28d，免疫組化染色以及超微結(jié)構(gòu)觀察ICC在結(jié)腸的分布及數(shù)量的變化。 結(jié)果： 1．酶切法以及PCR法證實利用同源重組法成功地構(gòu)建了含有人SCL基因的重組腺病毒載體，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染293細胞，獲得重組

8、腺病毒．Ad-SCL。病毒滴度測定可達1.6×10<'11>pfu/ml。 2．制備的重組腺病毒Ad-SCL對Hela細胞株以及體外培養(yǎng)的ICC具有很強的轉(zhuǎn)染效率。當MOI為50時，對Hela細胞的轉(zhuǎn)染效率為(90±1.825)％，當MOI為90時，對Hela細胞的轉(zhuǎn)染效率為(98.5±1.290)％。MTT細胞增殖實驗證實重組腺病毒Ad-SCL對Hela細胞生長沒有影響。RT-PCR證實重組腺病毒Ad-SCL可以介導SCL基因

9、在Hela細胞以及體外培養(yǎng)的Cajal間質(zhì)細胞中表達。 3．重組腺病毒Ad-SCL在體應用時，在ICC缺失模型鼠體內(nèi)有廣泛的分布；2d時綠色熒光蛋白表達最明顯，30d最弱；RT-PCR法證實在體應用重組腺病毒Ad-SCL后30d，在ICC缺失模型鼠結(jié)腸肌條內(nèi)仍然可以檢測到SCL mRNA的表達。 4．HE染色法顯示在體應用重組腺病毒Ad-SCL后，ICC缺失模型鼠結(jié)腸等臟器無明顯損傷表現(xiàn)。 5．Western b

10、lot檢測顯示，在體應用重組腺病毒Ad-SCL后，可以明顯上調(diào)ICC缺失模型鼠結(jié)腸肌條的c-kit蛋白的表達，2d可檢測到、7d最明顯、15d下降、30d恢復正常水平。 6．免疫組化染色以及超微結(jié)構(gòu)觀察顯示在重組腺病毒Ad-SCL和SCF聯(lián)合應用后14d，ICC缺失模型鼠結(jié)腸內(nèi)ICC．MP最先得到部分恢復；21d時，ICC-CM、ICC-LM以及ICC-SMB均得以部分恢復；28d時，ICC-MP、ICC-CM、ICC-LM以及

11、ICC-SMB得到完全恢復。 7．單純重組腺病毒Ad-SCL應用或單純SCF應用，免疫組化染色以及超微結(jié)構(gòu)觀察ICC缺失模型小鼠結(jié)腸ICC未見明顯恢復。 結(jié)論： 1．制備的重組腺病毒Ad-SCL對Hela細胞株、體外培養(yǎng)的Cajal間質(zhì)細胞以及在體器官均有較強的轉(zhuǎn)染效率，并且可以介導SCL基因在Hela細胞株、體外培養(yǎng)的Caial間質(zhì)細胞以及在體器官中表達。有較好的細胞水平以及在體水平的生物安全性。 2．

12、制備的重組腺病毒Ad-SCL可以上調(diào)ICC缺失模型鼠結(jié)腸肌條內(nèi)c-kit蛋白的表達。其機理可能是通過介導SCL基因的表達增加，轉(zhuǎn)而上調(diào)了c-kit蛋白表達。 3．聯(lián)合應用重組腺病毒Ad-SCL和SCF后，ICC缺失模型鼠結(jié)腸內(nèi)ICC得以恢復。聯(lián)合作用后14d，ICC開始恢復；聯(lián)合作用后28d，ICC得到完全恢復。單純腺病毒應用或單純SCF作用，ICC未見明顯恢復。 4．重組腺病毒Ad-SCL介導的SCL轉(zhuǎn)基因聯(lián)合SCF應