特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化LncRNA CDKN2B-AS1低表達預(yù)示肺癌高風(fēng)險的研究.pdf

1、特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是老年人常見的疾病，高發(fā)年齡為55-70歲，其主要病理改變?yōu)槌衫w維細胞增生和細胞外基質(zhì)沉積，通常會有多種合并癥，這些合并癥的存在對患者的生活質(zhì)量及存活率有著明顯的影響，甚至遠遠超過了呼吸困難本身。該病目前尚無有效治療方法，因此，及時發(fā)現(xiàn)并減少并發(fā)癥，改善患者預(yù)后是治療的關(guān)鍵。
　　目前研究證實IPF中異常的纖維化過程形成疤痕病灶，可能是肺癌發(fā)生

2、的潛在病灶，研究證實纖維化明顯的區(qū)域，更易合并肺癌，以非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）為主要病理類型。IPF合并肺癌的機理尚未完全闡明。一些信號通路被證實參與了這個過程，尤其是P53信號通路。近幾年的研究也證實，長鏈非編碼RNA（Long Noncoding RNA，LncRNA）介入了肺癌及IPF的發(fā)生發(fā)展。那么LncRNA是否在IPF中異常表達并促進其合并肺癌的過程機制如何。是否通過P

3、53通路促進腫瘤的形成。
　　為此，本課題收集IPF患者外周血液標本，通過高通量測序檢測其LncRNA及mRNA的差異表達，篩選出與肺癌通路相關(guān)的LncRNA及mRNA，通過同源性檢測后，進行動物實驗進一步驗證其相互關(guān)系，以期進一步闡明LncRNA在IPF中的作用以及促進合并肺癌的作用機制，為早期發(fā)現(xiàn)其合并癥提供新的思路。
　　本課題包括三部分，5個實驗，分述如下：
　　第一部分：特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化患者外周血LncRN

4、A測序分析及驗證
　　實驗一：特發(fā)性肺纖維化患者外周血LncRNA測序分析
　　目的：
　　檢測IPF患者外周血非編碼長鏈RNA（LncRNA）表達變化，通過生物信息學(xué)分析篩選出與癌癥P53通路相關(guān)的差異LncRNA及mRNA。
　　方法：
　　根據(jù)IPF診斷標準篩選4名患者和4名一般情況相當?shù)慕】底栽刚?，兩組患者均無高血壓糖尿病等其他疾病。分別留取患者靜脈血3ml，抽取RNA通過高通量測序法檢測LncRN

5、A和mRNA的表達，通過生物信息學(xué)分析，選出差異表達的LncRNA和mRNA，應(yīng)用GO分析和PATHWAY分析軟件，篩選出與腫瘤發(fā)生相關(guān)的mRNA。
　　結(jié)果：
　　1、通過高通量測序檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IPF患者外周血LncRNA與正常對照組相比較，共有440個表達上調(diào)，1376個表達下調(diào)。
　　2、通過生物信息學(xué)分析顯示LncRNA（CDKN2B-AS1）表達明顯下調(diào)，而且它的鄰近基因mRNA（CDKN2A）表達也明顯下

6、調(diào)（P<0.05)。
　　3、應(yīng)用GO分析及PATHWAY分析軟件分析發(fā)現(xiàn)CDKN2A富集在P53信號通路和NSCLC信號通路上，應(yīng)用Fisher法進行計算，結(jié)果顯示P值分別為0.013和0.0039。
　　實驗二： CDKN2B-AS1和CDKN2A在IPF患者外周血中表達的驗證
　　目的：
　　通過檢測20例IPF患者外周血，進一步驗證LncRNA CDKN2B-AS1和其鄰近基因CDKN2A mRNA的差異

7、表達。
　　方法：
　　再選取20例IPF患者和20例對照組，分別留取靜脈血抽提RNA進行PCR檢測，驗證篩選出來的LncRNA和mRNA在兩組的差異表達。
　　結(jié)果：
　　對20例IPF患者外周血進行RT-PCR驗證，同樣發(fā)現(xiàn)CDKN2B-AS1和CDKN2A在IPF組表達較對照組明顯下調(diào)。
　　第二部分：CDKN2B-AS1和CDKN2A在肺癌組織表達檢測
　　實驗三：人體肺癌組織和癌旁正常肺組織

8、CDKN2B-AS1和CDKN2A含量檢測
　　目的：
　　檢測CDKN2B-AS1和CDKN2A在肺癌組織中有無差異表達。
　　方法：
　　選取6例肺癌手術(shù)病人的癌標本和6例癌旁正常肺組織標本，PCR法檢測CDKN2B-AS1、CDKN2A分別在癌組織和癌旁正常肺組織的表達。
　　結(jié)果：
　　在肺癌組織中CDKN2B-AS1和CDKN2A表達均較周圍癌旁正常肺組織明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

9、　　第三部分：CDKN2B-AS1、CDKN2A低表達對P53的表達的影響
　　實驗四：博來霉素誘導(dǎo)鼠纖維化模型CDKN2B-AS1、CDKN2A和P53表達檢測
　　目的：
　　通過動物實驗進一步分析CDKN2B-AS1、CDKN2A的表達以及P53表達。進一步探討二者在IPF和肺癌中的作用機理。
　　方法：
　　通過生物信息學(xué)分析顯示該LncRNA在人類和小鼠中的同源性比較高。選取48只SPF級雄性野生

10、C57BL/6小鼠隨機分為四組：正常組、肺纖維化組、肺癌組，肺纖維化合并肺癌組，每組12只，分別造模，建立肺纖維化動物模型和肺癌動物模型以及肺纖維化合并肺癌模型，分別留取肺組織及血液標本。通過HE染色、Masson染色觀察纖維化程度， PCR法檢測CDKN2B-AS1、CDKN2A mRNA在各組中的表達，western-blot法檢測P53、CDKN2A蛋白在各組中的表達。
　　結(jié)果：
　　1、RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD

11、KN2B-AS1和CDKN2A在肺纖維化組表達較正常組明顯下調(diào)，在肺纖維化合并肺癌組下調(diào)更明顯，與正常組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CDKN2B-AS1和CDKN2A呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.985，P=0.000，CDKN2B-AS1和P53呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.860，P=0.000。
　　2、western法結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDKN2A、P53蛋白在正常組表達明顯，肺纖維化組下降，肺纖維化合并肺癌組

12、下降更明顯，與正常組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　實驗五：細胞水平檢測CDKN2B-AS1、P53和CDKN2A表達
　　目的：
　　通過細胞培養(yǎng)進一步驗證CDKN2B-AS1、CDKN2A的調(diào)控表達以及CDKN2A對P53表達的影響。進一步探討IPF合并肺癌的作用機理。
　　方法：
　　培養(yǎng)MRC5細胞，使用TGF-β1建立纖維化細胞模型。使用siRNA干擾CDKN2B-AS1。隨機分為6組，正

13、常組、干預(yù)組（加入TGF-β1干預(yù)）、陰性siRNA組、陰性siRNA干預(yù)組、陽性siRNA組、陽性siRNA干預(yù)組。倒置相差顯微鏡觀察各組的形態(tài)變化，PCR法檢測CDKN2B-AS1、CDKN2A在各組中的表達，western法檢測P53、CDKN2A在各組中的表達。
　　結(jié)果：
　　1、細胞水平倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)TGF-β1干預(yù)后，MRC5細胞形態(tài)變得更加細長。
　　2、PCR驗證發(fā)現(xiàn)siRNA干擾后，CDKN

14、2B-AS1和CDKN2A基本不表達。Pearson檢驗CDKN2B-AS1和CDKN2A呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.988，P=0.000，進一步說明CDKN2B-AS1和CDKN2A是臨近基因的關(guān)系，CDKN2B-AS1通過調(diào)控CDKN2A來發(fā)揮作用。
　　3、western-blot檢測結(jié)果TGF-?干預(yù)后CDKN2A蛋白表達減少，P53蛋白表達也明顯減少。
　　4、TGF-β1干預(yù)后MRC5細胞CDKN2B

15、-AS1、CDKN2A和P53的表達均明顯減少，Pearson檢驗結(jié)果CDKN2B-AS1和P53呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.772，P=0.000，提示CDKN2B-AS1與P53可能存在調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)論：
　　1、IPF患者外周血中LncRNA和mRNA存在差異表達，其中CDKN2B-AS1和它的鄰近基因CDKN2A表達明顯下調(diào)。
　　2、CDKN2B-AS1和CDKN2A在肺癌組織中表達減少，可能參