抗菌肽P3類似物JH-3的篩選及抗菌作用研究.pdf

1、傳統(tǒng)抗生素的濫用，臨床上多種耐藥菌株、超級(jí)細(xì)菌等的出現(xiàn)，對(duì)畜牧業(yè)的健康發(fā)展以及人類健康造成了極大的威脅。研制高效廣譜抗菌、不易產(chǎn)生耐藥性，且對(duì)機(jī)體低毒甚至無毒的新型抗菌藥物，以替代傳統(tǒng)抗生素，成為一項(xiàng)迫切的任務(wù)。在開發(fā)新型抗菌藥物的過程中，抗菌肽以其廣譜的抗菌活性進(jìn)入人們的視野，并逐漸成為研究的熱點(diǎn)。抗菌肽是生物體在抵抗外來微生物入侵時(shí)產(chǎn)生的一類防御性小肽，是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。與傳統(tǒng)的抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、水溶性

2、好、熱穩(wěn)定性好，抗菌機(jī)理獨(dú)特，對(duì)臨床耐藥細(xì)菌具有廣譜的抗菌活性，且不易誘發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。隨著研究的進(jìn)一步深入，人們還發(fā)現(xiàn)抗菌肽不僅具有良好的抗菌活性，還表現(xiàn)出良好的抗病毒、抗真菌、選擇性抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等生物活性，并且對(duì)動(dòng)物體的免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用。
　　本研究中，以本課題組由牛紅細(xì)胞血紅蛋白α亞基中分離到的抗菌肽P3為研究對(duì)象。通過對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列分析、分子設(shè)計(jì)等，以提高其殺菌活性，并對(duì)其溶血性、細(xì)胞毒性、特異性

3、選擇抑制Hela細(xì)胞活性進(jìn)行分析。通過CD掃描，對(duì)P3進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析；采用膜滲透性、掃描電鏡觀察、膜電位檢測(cè)等試驗(yàn)，對(duì)P3的膜破壞機(jī)制進(jìn)行初步的探索。分析P3進(jìn)入細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞內(nèi)液中鈣離子濃度平衡的干擾作用。結(jié)合P3的膜-肽作用機(jī)制，以闡明P3的殺菌機(jī)制。并通過構(gòu)建ICR小鼠感染模型，對(duì)P3及其類似物在小鼠體內(nèi)的抗感染活性進(jìn)行研究。
　　為了增強(qiáng)P3的抑菌活性，通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計(jì)了四條P3類似物序列，分別命名為JH-0、JH-1、JH-

4、2、JH-3。與P3相比，四種類似物對(duì)五種測(cè)試菌株的MIC值均有不同程度的升高，且溶血性、細(xì)胞毒性較小，其中JH-3對(duì)癌細(xì)胞Hela表現(xiàn)出良好的選擇性抑制活性。膜-肽作用機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)：P3在細(xì)菌磷脂膜模擬環(huán)境下，自身形成α-螺旋結(jié)構(gòu)；P3作用于細(xì)菌后，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性增加，并在細(xì)胞膜表面形成孔洞樣結(jié)構(gòu)、區(qū)域性裂解，對(duì)細(xì)胞膜的生理結(jié)構(gòu)形成物理性損傷，并造成細(xì)胞生理性膜電位的去極化。同時(shí)P3進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起胞漿內(nèi)的鈣震蕩，造成鈣超載。

5、P3通過對(duì)細(xì)胞膜以及細(xì)胞內(nèi)多樣化的作用方式最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。
　　ICR小鼠體內(nèi)毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：P3及其類似物在小鼠體內(nèi)的LD50均高于臨床常用藥物PMB，而且小鼠對(duì)腹腔注射時(shí)抗菌肽的吸收率優(yōu)于皮下注射。P3及其類似物對(duì)臨床耐藥菌感染ICR小鼠的保護(hù)率均大于60％，其中JH-3對(duì)感染小鼠的保護(hù)率高達(dá)90％，而Amp組和空白組的小鼠在20h內(nèi)全部死亡。并且在注射后2h，P3及其類似物可有效降低小鼠血液中的菌落含量，以JH-3組差異極其