腦紅蛋白抗自由基損傷機(jī)制的初步研究.pdf

1、自由基是機(jī)體正常代謝的中間產(chǎn)物，在生理狀態(tài)下人體內(nèi)自由基始終處于產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡過程中，而此平衡主要依靠機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)來維持。然而，過量的自由基是產(chǎn)生氧化應(yīng)激的重要因素，在機(jī)體內(nèi)較易與各種生物大分子發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞和組織氧化損傷。機(jī)體內(nèi)過多的自由基同時(shí)還是許多疾病產(chǎn)生的重要原因，如神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、腦中風(fēng)、腫瘤等，因此清除過量自由基已成為防治此類疾病的重要策略。腦紅蛋白(neuroglobin，Ngb)是Burmester于

2、2000年新發(fā)現(xiàn)的第三類攜氧珠蛋白，主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，與氧有很高的親和力，能促進(jìn)氧傳遞到線粒體，提高腦組織對氧的利用率，可作為內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子保護(hù)神經(jīng)元抵御缺血/缺氧性損傷。很多研究發(fā)現(xiàn)，具有攜氧能力的珠蛋白Ngb與清除過量自由基有關(guān)，這說明Ngb在清除過多自由基方面可能起重要作用，但目前多數(shù)報(bào)道是通過真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)和轉(zhuǎn)基因等手段，證明Ngb能夠清除過量的有害自由基，保護(hù)細(xì)胞和組織抵抗自由基損傷。那么，Ngb蛋白是否直接具有清除自

3、由基作用，其機(jī)理如何?這一問題尚未得到明確回答。本文擬對此進(jìn)行重點(diǎn)研究。
　　 首先，利用體外和細(xì)胞內(nèi)測定抗氧化劑清除自由基活性的研究方法，對重組人源腦紅蛋白(recombinant human neuroglobin，rhNgb)的抗氧化能力、清除自由基活性、金屬螯合能力以及對DNA氧化損傷的保護(hù)作用進(jìn)行測定?？紤]到Ngb作為攜氧珠蛋白家族中的一員，其抗氧化能力是一個(gè)比較特定的功能，我們分別采用ABTS法和鐵氰化鉀還原法對rh

4、Ngb的抗氧化和還原能力進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rhNgb具有一定的抗氧化能力，但其抗氧化能力要低于常規(guī)抗氧化劑Vc、GSH以及NAC；而還原能力測定結(jié)果表明，rhNgb幾乎無還原能力，這可能與rhNgb本身的氧化還原狀態(tài)有關(guān)。
　　 由于抗氧化劑清除氧自由基的活性是其抗氧化屬性的重要指標(biāo)，因此在研究rhNgb抗氧化和還原能力的同時(shí)，我們對其清除超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等進(jìn)行了測定。本實(shí)驗(yàn)中rhNgb清除超氧陰離子、過氧化氫、羥

5、自由基活性的檢測分別采用四唑硝基藍(lán)(nitro blue tetrazolium，NBT)-光還原法、H2O2滅活酶法、鄰二氮菲-Fe(Ⅱ)比色法進(jìn)行。結(jié)果表明，rhNgb具有明確的清除超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等活性。進(jìn)一步分析可知，rhNgb對超氧陰離子有很強(qiáng)的清除能力，其活性與Vc相差不大；rhNgb對過氧化氫的清除活性也較強(qiáng)，但其清除羥自由基能力較弱，與Vc和NAC相比有一定差距。另外，我們還對rhNgb的過氧化物酶活性和清

6、除DPPH自由基能力進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rhNgb幾乎沒有過氧化物酶活性，也沒有清除DPPH自由基的能力。
　　 在證明rhNgb具有上述清除自由基活性的同時(shí)，為了更好地研究Ngb在抗自由基損傷方面的其他活性，我們還對rhNgb的Fe(Ⅱ)螯合能力和對DNA氧化損傷的保護(hù)作用進(jìn)行了探討。過渡金屬在機(jī)體內(nèi)易于發(fā)生Fenton反應(yīng)，產(chǎn)生羥自由基，因此抗氧化劑的金屬螯合能力也是其抗氧化能力的一種體現(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rhNgb對過渡金屬F

7、e(Ⅱ)具有一定的螯合能力，但其螯合能力并非完全的濃度依賴性，在低濃度rhNgb時(shí)，其金屬鐵離子的螯合能力隨著rhNgb濃度升高而增加，當(dāng)rhNgb達(dá)到一定濃度時(shí)，其螯合能力開始下降。這可能與rhNgb中存在的鐵卟啉環(huán)有一定的關(guān)系。
　　 為了更好地理解rhNgb是否對細(xì)胞內(nèi)的自由基也具有清除活性，我們對rhNgb的細(xì)胞毒性和清除細(xì)胞過量活性氧(reactive oxygen species，ROS)進(jìn)行了檢測。目前對細(xì)胞內(nèi)RO

8、S檢測方法有很多，從靈敏度等角度出發(fā)，我們選用靈敏度較高的DCFH-DA熒光探針法對rhNgb清除PC12細(xì)胞內(nèi)過量ROS能力進(jìn)行了研究。同時(shí)，為了便于確定rhNgb對PC12細(xì)胞內(nèi)過量ROS的清除作用是否與rhNgb對細(xì)胞的毒性損傷有關(guān)，我們還采用CCK-8法對rhNgb的PC12細(xì)胞毒性進(jìn)行了測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rhNgb具有一定的清除PC12細(xì)胞內(nèi)過量ROS的能力，且沒有細(xì)胞毒性。
　　 進(jìn)一步，通過對不同物種的Ngb蛋白和m

9、RNA序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)組氨酸(histidine，His)在Ngb蛋白功能中起重要作用，因而推測His是Ngb蛋白中的關(guān)鍵氨基酸，并在此基礎(chǔ)上使用引物突變法分別構(gòu)建了突變體Ngb的原核表達(dá)載體(His64和His96單突變原核表達(dá)載體pBV220-Ngb(H64V)、pBV220-Ngb(H96A)和His64/96雙突變原核表達(dá)載體pBV220-Ngb(H64V/H96A))，通過測序證明載體構(gòu)建成功。

10、同時(shí)，對突變體Ngb進(jìn)行了原核表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含突變體Ngb原核表達(dá)的菌體呈淺黃色(野生型Ngb原核表達(dá)產(chǎn)物為紅色)。突變體的表達(dá)產(chǎn)物離心收集并超聲裂解后，經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting分析可知，突變體Ngb能夠正常表達(dá)，為研究上述關(guān)鍵氨基酸(His64、His96)在Ngb功能發(fā)揮中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為后續(xù)研究Ngb清除自由基的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 綜上所述，本文在對rhNgb的抗氧化劑活性進(jìn)行

11、一系列研究的基礎(chǔ)上，證明rhNgb是一種潛在的抗氧化劑，具有抗氧化能力，能夠直接清除自由基，并能夠清除細(xì)胞內(nèi)過量的ROS，同時(shí)還證明rhNgb對Fe(Ⅱ)具有螯合能力，對自由基造成的DNA損傷有一定的保護(hù)作用，而且其抗氧化能力和清除自由基活性可能是抗氧化損傷的關(guān)鍵所在，為進(jìn)一步揭示Ngb的功能并向臨床應(yīng)用過渡提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Ngb序列分析以及系列Ngb突變體表達(dá)載體的成功構(gòu)建和表達(dá)，對于后續(xù)研究組氨酸在Ngb中的作用提供了物質(zhì)保障