2-DE結合多維色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析阿替洛爾對映異構體作用于血管平滑肌細胞時的差異表達蛋白.pdf

1、目的：β-受體阻滯劑（Beta-blockers）是一系列具有手性特征的藥物，其中阿替洛爾（Atenolol，AT）為選擇性β1受體阻滯劑，臨床用于治療高血壓、心絞痛及心律失常，也用于治療青光眼。阿替洛爾化學名為2-[4-[2-Hydroxy-3-（isopropylamino）propoxy]phenyl]acetamide，因其分子中有一個手性中心，存在著一對對映異構體（enantiomers），目前臨床上使用的制劑均以S和R對映體

2、各半混合的外消旋體（racemate）形式給藥。但是，這兩種對映體不僅在藥理作用的類型、強度而且在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝等方面都存在顯著差異，其S型的心臟β阻斷活性是R型的46倍。近年來，有關阿替洛爾在臨床治療中的副作用多有報道，并由此引起了關于β受體阻滯劑是否應該從一線藥物中撤除的熱烈討論。因此，研究阿替洛爾兩種光學異構體的分子作用機制的差別有著重要的理論和實際意義。 蛋白質(zhì)組學與藥學的學科交叉逐漸形成新的研究領域-藥物蛋

3、白質(zhì)組學。其研究內(nèi)容在臨床前包括：發(fā)現(xiàn)所有可能的藥物作用靶點，以及針對這些靶點的全部可能的化合物。也包括應用蛋白質(zhì)組學方法研究藥物作用機制和毒理學；在臨床研究方面包括：藥物作用的特異蛋白作為患者選擇有效藥物的依據(jù)和臨床診斷的標志物，也可應用類似于藥物遺傳學的方法，按照蛋白質(zhì)譜來分類患者，給予個體化治療，并預測藥物療效。二維凝膠電泳和質(zhì)譜的結合與精致的生物信息學建立了一套強有力的、通用的方法，為藥物蛋白質(zhì)組學研究提供了技術支持。

4、本文以阿替洛爾（R），（S）對映異構體作用于血管平滑肌細胞提取的蛋白質(zhì)為研究對象，以雙向電泳技術初步分離蛋白質(zhì)，再對差異表達蛋白點進行酶解，通過HPLC-CHIP富集、分離酶解肽混合物，線性離子阱質(zhì)譜途徑在線鑒定差異蛋白，以求對阿替洛爾對映異構體與靶蛋白間的相互作用和β-受體阻滯劑類手性藥物作用機制有更深入的了解，從而為手性藥物的開發(fā)提供全新的研究策略和實驗依據(jù)。 方法：蛋白樣品的制備：將VSMC在DMEM培養(yǎng)液中，含胎牛血清（

5、FBS）10％、37℃、5％CO2、濕度為90％的環(huán)境中培養(yǎng)。達到細胞對數(shù)生長期時改用含有阿替洛爾和阿替洛爾的培養(yǎng)液中培養(yǎng)液培養(yǎng)。運用MTT法測定藥物細胞毒性，以確定作用藥物濃度。接種對數(shù)生長期的細胞于96孔板，待細胞處于對數(shù)生長期用不含有血清分別含消旋的阿替洛爾0、0.15、1.5、15、30、60、120、μmol/L的培養(yǎng)液孵育細胞4小時后棄去培養(yǎng)液，用5mg/mLMTT的PBS溶液作用4小時后吸出所有溶液用100μLDMSO溶解

6、，590nm掃描酶標儀測定數(shù)據(jù)。 雙向電泳：分別用120μmol/L的R-阿替洛爾和S-阿替洛爾處理細胞4小時后，用刮取法收集細胞，按照用水化上樣緩沖液Ⅱ提取細胞全蛋白，-80℃保存各蛋白樣品。均用固相pH膠條（17cm，pH3～10）進行分析。200μg蛋白樣品在重泡脹液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％CHAPS，30mmol/LDTT，0.5％IPG緩沖液，痕量溴酚藍）中重懸，被動水化過夜（12～16h）。之后進行

7、雙向電泳（一向：IEF；二向：12％SDS-PAGE電泳），根據(jù)Bio-Rad雙向電泳實驗指南進行。2-DE的分離結果用經(jīng)典質(zhì)譜兼容銀染法染色后進行圖像掃描，以PDQest7.4.0圖像分析軟件分析凝膠并尋找差異點。根據(jù)差異分析結果，兩種樣品中的同一種蛋白質(zhì)如存在1.5倍以上的光密度差異，則視為具有表達量的差異。 HPLC-CHIP/MS分析：富集柱等度洗脫條件：流動相為0.1％（v/v）甲酸-超純水溶液，流速：4μL/min；

8、分離柱梯度洗脫條件：流動相A為0.1％（v/v）甲酸-超純水溶液，流動相B為0.1％（v/v）甲酸-乙腈溶液，起始流動相為3％（v/v）B，保持2min，17min時流動相B為55％（v/v），20min時B為75％（v/v），保持5min，流速：0.3μL/min。UltraXCTiontrapMassSpectrometer以CHIPcube作為離子源，毛細管電壓2000V，干燥氣流速0.32L/min，干燥氣溫度325℃，質(zhì)量掃描

9、范圍m/z：300～1500Da。 SpectrumMillMSProteomicsWorkbench（RevA.03.03.078）自動分析MS和MS/MS數(shù)據(jù)，搜索UniProtKB/SWISS-PORT，HomoSapiens（Human）數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫搜索參數(shù)設置：Trypsin（胰蛋白酶），MonoisotopicMassvalues（單同位素質(zhì)量），Peptidetol.（母離子質(zhì)量允差）±2.5Da，MS/MSto

10、l.（MS/MS質(zhì)量允差）±0.7Da，Carbamidometholation（C）修飾。搜索后自動以下列條件進行有效性驗證：蛋白評分大于11.0；肽評分大于6.0；SPI（Structurepredictabilityindexforproteinsequences）大于60％。 結果：通過MTT實驗，確定在120μmol/L下選擇實驗濃度都是可行的，最終實驗以120μmol/L為阿替洛爾的濃度。通過優(yōu)化條件，最終確定合適的

11、樣品上樣量為200μg、染色方法為銀染通過對R-ATE和S-ATE作用動脈平滑肌細胞后的二維凝膠電泳圖譜進行分析，發(fā)現(xiàn)約有6個蛋白斑點表達有差異，對6個差異蛋白斑點進行LC-CHIP-MS/MS分析后，鑒定出了6種可能的差異表達蛋白。 結論：本文建立了新的分析阿替洛爾（R），（S）對映異構體作用于VSMC的差異蛋白的雙向電泳和多維色譜串聯(lián)質(zhì)譜策略。鑒定出的6種差異表達蛋白可能在R-AT與S-AT手性生物學特征的發(fā)生機制中起有重要