Phsp70-IκBαm抑制NF-κB防治小鼠急性肺損傷的自控性和有效性研究.pdf

1、研究背景：
　　急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合癥（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是多種致病因素引起的全身炎癥反應(yīng)失控，炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生、釋放，從而導(dǎo)致肺泡上皮、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮等發(fā)生廣泛的、非特異性損傷的急性病理過程，進(jìn)展快、死亡率高，目前尚無有效的防治藥物?；蚍乐问茿LI/ARDS很有前景的預(yù)防與治療手段，但選擇何種靶基因及如何實(shí)現(xiàn)靶

2、基因的可控性表達(dá)是目前基因治療尚未解決的兩大難題。
　　NF-κB過度活化是ALI炎癥反應(yīng)失控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。NF-κB能與多種炎癥因子基因啟動子區(qū)的κB位點(diǎn)特異性結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成；同時NF-κB也可以抑制肺內(nèi)中性粒細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)持續(xù)時間延長。因此，NF-κB是調(diào)控ALI炎癥反應(yīng)的重要干預(yù)靶點(diǎn)。細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，胞漿中NF-κB與其抑制分子IκB結(jié)合，所以不能入核發(fā)揮作用；當(dāng)細(xì)胞受到LPS等刺激時，IκB的3

3、2及36位絲氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，進(jìn)而被泛素化酶識別、降解，解除了對NF-κB的抑制，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用。因此，IκB磷酸化是NF-κB通路激活的關(guān)鍵，無法磷酸化的突變體IκBα（32及36位絲氨酸位點(diǎn)突變?yōu)楸彼幔﹦t可有效抑制NF-κB入核及NF-κB通路的活化。但是，NF-κB是具有重要生理功能的轉(zhuǎn)錄因子，過度抑制NF-κB活性可能對機(jī)體同樣有害。因此，根據(jù)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱調(diào)節(jié)NF-κB的活化水平、實(shí)現(xiàn)對ALI炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的反

4、饋性調(diào)節(jié)是本課題的重要目標(biāo)。
　　熱休克蛋白70（HSP70）是細(xì)胞重要的應(yīng)激反應(yīng)蛋白之一。ALI時，失控的炎癥反應(yīng)可以引起細(xì)胞強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞HSP70的大量表達(dá)。研究表明，在一定劑量范圍內(nèi)，LPS引起機(jī)體炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和細(xì)胞HSP70的表達(dá)水平之間呈正相關(guān)。因此可以推測:LPS刺激引起的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度與HSP70啟動子活性可能存在正性相關(guān)，利用HSP70啟動子驅(qū)動突變體IκB（即32和36位絲氨酸突變）的表達(dá)，可能實(shí)現(xiàn)根

5、據(jù)炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱反饋調(diào)節(jié)突變體IκB表達(dá)、進(jìn)而反饋性調(diào)節(jié)NF-κB活性及其下游炎癥因子表達(dá)水平，即機(jī)體炎癥反應(yīng)的負(fù)反饋調(diào)控的目的。
　　研究目的與意義：
　　1.研究目的：
　?。?）構(gòu)建HSP70啟動子驅(qū)動的IκB突變體基因治療載體—Phsp70/IκBαm。
　?。?）通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測Phsp70/IκBαm載體對LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI的防治作用以及對不同劑量LPS誘導(dǎo)的ALI炎癥反應(yīng)的反應(yīng)性。
　?。?

6、）在體外實(shí)驗(yàn)中，通過與強(qiáng)啟動子CMV驅(qū)動的IκBα突變體載體進(jìn)行比較，驗(yàn)證構(gòu)建的Phsp70/IκBαm基因治療載體能否實(shí)現(xiàn)根據(jù)炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱反饋調(diào)節(jié)突變體IκBα表達(dá)，進(jìn)而反饋性調(diào)節(jié)NF-κB活性及其下游炎癥因子表達(dá)水平，即對機(jī)體炎癥反應(yīng)的負(fù)反饋調(diào)控的目的。
　　2.研究意義
　　通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)，探索Phsp70/IκBαm基因治療載體自控性、有效性抑制NF-κB活性進(jìn)而調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)的可行性。克服強(qiáng)啟動子驅(qū)動策略對組織

7、細(xì)胞中NF-κB活性的過度抑制作用，最大限度減低基因防治的副作用。本課題在ALI基因治療靶基因和可控性表達(dá)方面進(jìn)行了有益的探索，將為ALI及其它炎癥相關(guān)疾病的基因治療提供新思路和線索。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.動物實(shí)驗(yàn)
　　4~6周齡BALB/c小鼠（體重18g左右），適應(yīng)環(huán)境2天后，隨機(jī)分為四組：1）生理鹽水（NS）對照組（n=5），給小鼠尾靜脈注射NS，24h后氣管內(nèi)滴注 NS；2）Phsp70/IκBαm對照組（

8、n=5），先給小鼠尾靜脈注射經(jīng)活體轉(zhuǎn)染試劑包被好的Phsp70/IκBαm質(zhì)粒，24h后氣管內(nèi)滴注NS；3） LPS組，先給小鼠尾靜脈注射NS，24h后氣管內(nèi)分別滴注不同濃度LPS，即0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg三個濃度組（n=5/組）；4）Phsp70/IκBαm/LPS組（n=5/組），先給小鼠尾靜脈注射包被好的Phsp70/IκBαm質(zhì)粒，24h后同樣分為三個濃度組進(jìn)行氣管內(nèi)滴注LPS。12h后收集肺臟、心臟和肝臟

9、組織檢測IκB和磷酸化NF-κB表達(dá)、炎癥因子的變化，觀察肺組織濕干比值、MPO活性和肺組織學(xué)病理變化。
　　收集并檢測支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的蛋白含量、炎癥因子。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　將處于對數(shù)生長期A549和RAW264.7細(xì)胞無血清培養(yǎng)18h后，進(jìn)行細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24h分別以0.01μg/mL、0.1μg/mL和1μg/mL的LPS刺激細(xì)胞12h。
　　為了確定HSP70啟動子是否可以有效啟

10、動IκBαm表達(dá)并抑制磷酸化NF-κB的表達(dá)，且呈劑量依賴性量效關(guān)系。Phsp70/IκBαm載體瞬時轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞系RAW264.7和肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，48h后利用RT-PCR和Western-blot方法檢測IκBαm mRNA和蛋白及磷酸化NF-κB蛋白表達(dá)變化。
　　為了觀察Phsp70/IκBαm載體對A549細(xì)胞的保護(hù)作用，Phsp70/IκBαm載體瞬時轉(zhuǎn)染于A549細(xì)胞，48h后經(jīng)LPS刺激12h，采用MT

11、T方法檢測細(xì)胞活力，收集培養(yǎng)上清，檢測細(xì)胞損傷指標(biāo)LDH活性。
　　為了觀察Phsp70/IκBαm載體對RAW264.7和A549細(xì)胞分泌炎癥因子影響，Phsp70/IκBαm載體瞬時轉(zhuǎn)染 RAW264.7和A549細(xì)胞，48h后經(jīng)LPS刺激12h，收集細(xì)胞上清培養(yǎng)液，采用ELISA方法檢測細(xì)胞上清中炎癥因子TNF-α和IL-6含量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1. Phsp70/IκBαm載體能夠根據(jù)炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度反

12、饋調(diào)節(jié) LPS誘導(dǎo)的肺損傷
　　通過檢測肺損傷指標(biāo)，觀察Phsp70/IκBαm對小鼠ALI的治療作用，結(jié)果顯示：Phsp70/IκBαm對肺水腫有顯著改善作用，可有效降低 LPS刺激后小鼠肺濕干比值，不同濃度LPS刺激后濕干比的降低比率分別為3.1％、16.9和39.1%；Phsp70/IκBαm可以有效改善ALI肺組織的病理學(xué)改變，包括肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤減少，肺間質(zhì)增厚、肺泡腔變窄、點(diǎn)片狀出血、肺組織水腫和肺不張等現(xiàn)象均有減輕

13、；Phsp70/IκBαm可以降低肺組織MPO活性和BALF中蛋白含量，抑制率分別為4.3%、23.5%、52.3%和0.1%、5.7%、18.3%。結(jié)果顯示Phsp70/IκBαm的抑制率與LPS刺激劑量即炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱呈正相關(guān)。
　　2. Phsp70/IκBαm載體可呈LPS劑量依賴性反饋降低LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)入Phsp70/IκBαm，肺組織內(nèi)IκBα表達(dá)水平可顯著升高；LPS刺激后，小

14、鼠肺組織內(nèi)磷酸化NF-κB活化水平呈LPS刺激濃度依賴性被抑制；BALF中炎癥因子TNF-α、IL-6水平呈LPS濃度依賴性顯著降低，抑制率分別為9.6%、29.2%、35.8%和13.0%、19.2%、37.7%。表明Phsp70/IκBαm載體可根據(jù)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱反饋調(diào)節(jié)NF-κB活化水平及炎癥因子表達(dá)水平。
　　3. Phsp70/IκBαm載體可呈LPS劑量依賴性反饋降低LPS誘導(dǎo)細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)
　　通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

15、證實(shí)Phsp70/IκBαm對肺部炎癥及肺損傷的防治作用后，我們進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)探討了Phsp70/IκBαm的有效性和可控性。結(jié)果顯示：Phsp70/IκBαm分別瞬時轉(zhuǎn)染A549和RAW264.7細(xì)胞48h后，IκBα表達(dá)顯著升高，LPS刺激后IκBα表達(dá)呈LPS濃度依賴性顯著升高；與空載體及陽性對照載體相比，Phsp70/IκBαm可有效抑制磷酸化NF-κB，且抑制作用呈LPS濃度依賴性。轉(zhuǎn)染空載體組磷酸化NF-κB表達(dá)繼續(xù)顯著

16、升高，而轉(zhuǎn)染陽性對照載體后磷酸化NF-κB表達(dá)被顯著抑制，但抑制效果無LPS濃度依賴趨勢。
　　細(xì)胞損傷指標(biāo)檢測結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染 Phsp70/IκBαm后，A549細(xì)胞活力呈 LPS濃度依賴性升高，不同濃度 LPS刺激后細(xì)胞活力升高比率分別為0.8%、6.9%和12.5%。轉(zhuǎn)染空載體后A549細(xì)胞活力明顯降低，而轉(zhuǎn)染陽性對照載體后A549細(xì)胞活力雖可改善，但效應(yīng)和LPS濃度無關(guān)。LDH檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Phsp70/IκBαm后，

17、A549細(xì)胞LDH活性被抑制，抑制率分別為11.2%、14.3%和26.2%。轉(zhuǎn)染空載體后，A549細(xì)胞LDH活性顯著升高，細(xì)胞損傷嚴(yán)重。而轉(zhuǎn)染陽性對照載體后，A549細(xì)胞 LDH活性被強(qiáng)效抑制，但抑制效果與 LPS濃度無關(guān)。ELISA方法檢測結(jié)果顯示，Phsp70/IκBαm可有效抑制LPS刺激后A549細(xì)胞TNF-α和IL-6的合成與分泌，抑制率為TNF-α分別被降低了5.5%、17.8%和24.4%，IL-6抑制率分別為0.5%、

18、7.7%和20.8%。Phsp70/IκBαm對RAW264.7細(xì)胞TNF-α的抑制率為分別10.1%、27.5%和46.4%，對IL-6的抑制率分別為13.6.7%、27.6%和40.8%。轉(zhuǎn)染空載體組炎癥因子含量仍明顯增加，轉(zhuǎn)染陽性載體后，炎癥因子被強(qiáng)效抑制，但抑制率與刺激程度不相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1. Phsp70/IκBαm載體能夠根據(jù)炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度反饋調(diào)控突變體IκBα表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB活性及NF-κ