實(shí)驗(yàn)性咬合紊亂致大鼠髁突骨關(guān)節(jié)炎病理改變中SDF-CXCR信號軸及OPG-RANKL表達(dá)變化.pdf

1、顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)?。═emporomandibular joint osteoarthritis，TMJ-OA）是以關(guān)節(jié)軟骨組織面的破壞與耗損為主要特征，伴發(fā)軟骨下骨組織改建和滑漠相應(yīng)病變的一種退行性疾病。漸進(jìn)性咬合紊亂指后牙缺失后，對頜牙生長，鄰牙向缺隙傾斜而逐漸形成的上下牙尖窩不吻合的咬合接觸狀態(tài)。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)漸進(jìn)性咬合紊亂可以導(dǎo)致下頜髁突軟骨出現(xiàn) OA樣的退行性病變。
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過漸進(jìn)性咬合紊亂建立大鼠 TMJ-OA病理

2、模型，檢測髁突軟骨中炎癥趨化因子(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)/趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor-4，CXCR4)信號軸及其下游通路，以及骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG）及其配體(the receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL)的改變及與OA病變的關(guān)系，以期探討異常生物力

3、致 TMJ-OA軟骨退變的核心通路，從而為顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的防治探尋新的藥物靶點(diǎn)。
　　實(shí)驗(yàn)一，SDF-1/CXCR4信號軸及其下游因子在TMJ-OA大鼠模型中的研究
　　目的：研究SDF-1/CXCR4信號軸及其下游因子在TMJ-OA大鼠模型中的表達(dá)變化及作用。方法：雌性SD大鼠12只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和模擬操作對照組，每組6只。將正畸用皮圈插入右側(cè)上頜及左側(cè)下頜第一磨牙與第二磨牙之間，推第一磨牙向近中移動。一月后用相同方

4、法分開右側(cè)上頜及左側(cè)下頜第二磨牙與第三磨牙之間的間隙，在間隙處放置自凝塑料保持間隙，確保間隙直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對照組大鼠接受除未造成咬合紊亂外，其余處理同實(shí)驗(yàn)組。飼養(yǎng)24周后處死大鼠取出雙側(cè)TMJ，對左側(cè)進(jìn)行RNA提取，右側(cè)制成切片。利用免疫組化和Real-Time PCR技術(shù)檢測SDF-1/CXCR4，白介素6（Interleukin6，IL-6），基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteases9，MMP9）在蛋白和基因

5、水平的表達(dá)變化。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨中、后部出現(xiàn)明顯地病理改變，主要包括細(xì)胞排列不規(guī)則，軟骨表面破損，出現(xiàn)無細(xì)胞區(qū)，軟骨細(xì)胞釘突樣增生等。陽性細(xì)胞面積百分比分析結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組 CXCR4，MMP9，IL-6的蛋白表達(dá)出現(xiàn)明顯增強(qiáng)（P<0.05），同時實(shí)驗(yàn)組SDF-1，CXCR4，MMP9，IL-6的mRNA水平也出現(xiàn)顯著上升（P<0.05）。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性咬合紊亂在較長時間點(diǎn)仍可致大鼠下頜髁突軟骨出現(xiàn)明顯的退行性改變，同時SDF

6、-1/CXCR4信號軸及其下游因子IL-6、MMP-9的蛋白及基因表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的升高，提示該信號軸可能在 TMJ-OA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，但其確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
　　實(shí)驗(yàn)二，OPG/RANKL在TMJ-OA大鼠模型中的研究
　　目的：研究OPG/RANKL TMJ-OA大鼠模型中的表達(dá)變化及作用。方法：雌性SD大鼠12只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和模擬操作對照組，每組6只。漸進(jìn)性咬合紊亂模型建立后，24周后處死大鼠

7、取出雙側(cè)TMJ，對左側(cè)進(jìn)行RNA提取，右側(cè)制成切片。測量鈣化軟骨層厚度，并進(jìn)行破骨細(xì)胞染色。利用免疫組化和Real-Time PCR技術(shù)檢測OPG/RANKL在蛋白和基因水平的表達(dá)變化。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨中、后部出現(xiàn)明顯地軟骨退行性改變，且與對照組相比實(shí)驗(yàn)組鈣化軟骨層厚度明顯增厚（P<0.05）?？咕剖崴嵝粤姿崦福╰artrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色結(jié)果顯示對照組和實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞分布

8、及數(shù)量類似。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組 OPG的蛋白及mRNA表達(dá)均出現(xiàn)顯著增強(qiáng)（P<0.05），RANKL的蛋白及mRNA表達(dá)與對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組OPG/RANKL的mRNA表達(dá)比值出現(xiàn)明顯增高，并接近具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.056）。結(jié)論：OPG濃度升高可能是軟骨細(xì)胞對軟骨破壞的一種代償性反應(yīng)。而這種代償可能并不能真正阻擋OA的繼續(xù)變化，反而從某種程度上加劇了病情的發(fā)展。
　　實(shí)驗(yàn)三，周期性張應(yīng)力及SD

9、F刺激對ATDC5細(xì)胞CXCR，IL-6，膠原X表達(dá)的影響
　　目的：對由ATDC5細(xì)胞誘導(dǎo)所得的軟骨細(xì)胞進(jìn)行周期性張應(yīng)力及SDF-1刺激，并分別檢測CXCR，IL6及膠原X的表達(dá)變化，以期在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討SDF/CXCR信號軸在OA中的作用機(jī)制。方法：使用胰島素鐵硒傳遞蛋白對ATDC5細(xì)胞系誘導(dǎo)3周，之后分為加力和不加力兩大組，每大組又分為陰性對照和SDF刺激兩小組。對加力組施以20％形變的拉伸力12h。加力結(jié)束后

10、，對所有分組細(xì)胞提取總蛋白，使用Western blot對CXCR，IL6及膠原X的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果：在不加力狀態(tài)下，給予SDF刺激后，軟骨細(xì)胞CXCR，IL6以及膠原X的表達(dá)都出現(xiàn)了不同程度的增強(qiáng)；而在20%形變力和SDF的雙重刺激下，軟骨細(xì)胞此三種因子的表達(dá)出現(xiàn)進(jìn)一步增強(qiáng)。結(jié)論：在異常應(yīng)力作用下，SDF可通過上調(diào)其特異性受體CXCR的表達(dá)進(jìn)而增大與其結(jié)合的效率，最終促使SDF/CXCR信號軸的激活，一方面導(dǎo)致如 IL6等炎癥因子的