來那度胺對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226 Cereblon表達(dá)水平的影響.pdf

1、目的:Cereblon(CRBN)是廣泛表達(dá)E3連接酶的蛋白，其介導(dǎo)來那度胺在骨髓瘤細(xì)胞發(fā)揮抗增殖活性，并誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)來那度胺的抗骨髓瘤活性需要Cereblon的表達(dá)，對CRBN蛋白功能有抑制作用，且CRBN是來那度胺治療多發(fā)性骨髓瘤重要的分子靶點。本實驗旨在研究免疫調(diào)節(jié)劑來那度胺及蛋白酶體抑制劑硼替佐米對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖、凋亡及Cereblon表達(dá)水平的影響。
　　1、觀察免疫調(diào)節(jié)劑來那度胺及蛋白酶體抑制

2、劑硼替佐米抑制骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226增殖的作用。
　　2、檢測免疫調(diào)節(jié)劑來那度胺及蛋白酶體抑制劑硼替佐米對骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　3、觀察分析免疫調(diào)節(jié)劑來那度胺及蛋白酶體抑制劑硼替佐米對骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226 Cereblon(CRBN)基因表達(dá)的影響。
　　4、觀察分析免疫調(diào)節(jié)劑來那度胺及蛋白酶體抑制劑硼替佐米對骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226 Cereblon(CRBN)蛋白表達(dá)的

3、影響。
　　方法:
　　1、首先選取人骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226為研究對象，用CCK8比色法檢測來那度胺及硼替佐米對骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226增殖的抑制作用。
　　2、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測來那度胺及硼替佐米誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226凋亡的作用;
　　3、應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測來那度胺及硼替佐米對骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226 CRBN基因表達(dá)的影響。
　　4、應(yīng)用Western Blot方法檢測來那

4、度胺及硼替佐米對骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226 CRBN蛋白表達(dá)的影響。
　　5、實驗分組如下:(1)空白對照組:不加入任何藥物，即來那度胺濃度為0nmol/L;(2)來那度胺干預(yù)組:預(yù)實驗中分別以200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L濃度干預(yù)細(xì)胞24h、48h、72h，檢測結(jié)果以干預(yù)24h后最理想，而干預(yù)48h，72h后細(xì)胞凋亡偏多，放下述實驗均以干預(yù)24h為主，來檢測來那度胺對RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制作

5、用。(3)硼替佐米干預(yù)組:以10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L濃度分別干預(yù)細(xì)胞24h，來檢測硼替佐米對RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　6、實驗分組如下:(1)空白對照組:不加入任何藥物，即來那度胺濃度為0nmol/L;(2)來那度胺干預(yù)組:以200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L濃度的來那度胺分別干預(yù)細(xì)胞24h，來檢測來那度胺對骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226的促凋亡作用。(3)硼替佐米

6、干預(yù)組:以10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L濃度硼替佐米分別干預(yù)細(xì)胞24h，來檢測硼替佐米對骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226的促凋亡作用。
　　7、實時熒光定量PCR檢測上述不同濃度來那度胺及硼替佐米對RPMI8226細(xì)胞的CRBN基因表達(dá)水平的影響。
　　8、Western Blot檢測上述不同濃度來那度胺及硼替佐米對RPMI8226細(xì)胞的CRBN蛋白表達(dá)水平的影響。
　　9、應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件

7、，方差分析方法處理數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)用3次獨立實驗的平均值表示，實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示;P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、來那度胺及硼替佐米作用于RPMI8226細(xì)胞均可以抑制其增殖。(1)分別以200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L濃度的來那度胺干預(yù)細(xì)胞24h;各組抑制率分別為（16.67±0.25）％、（26.35±1.21）％、（36.26±1.03）％，呈劑量依賴性，

8、藥物作用濃度越高，抑制率越高，抑制作用越明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)(Fig.1，Table1)。(2)分別以10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L濃度的硼替佐米干預(yù)細(xì)胞24h;各組抑制率分別為（8.13±1.14）％、（18.46±0.21）％、(31.43±1.64)％;呈劑量依賴性，藥物作用濃度越高，抑制率越高，抑制作用越明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)(Fig.2, Table2)。
　　2、來那度胺

9、及硼替佐米對RPMI8226細(xì)胞的促凋亡作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:(1)分別以0nmol/L、200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L來那度胺干預(yù)細(xì)胞24h，各組凋亡率分別為（7.12±0.59）％、(17.89±0.31)％、(29.4±0.71)％、(40.33±1.25)％，呈劑量依賴性,藥物作用濃度越高，凋亡率越高，促凋亡作用越明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)(Fig.3，F(xiàn)ig.5，Table3)。(

10、2)分別以0nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L硼替佐米干預(yù)細(xì)胞24h，各組凋亡率分別為(7.82±0.33)％、(14.26±0.60)％、(25.22±0.26)％、(34.54±1.24)％，呈劑量依賴性，藥物作用濃度越高，凋亡率越高，促凋亡作用越明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)(Fig.4，F(xiàn)ig.6，Table4)。
　　3、來那度胺及硼替佐米對CRBN基因表達(dá)的影響。實時熒光定量PCR結(jié)

11、果顯示:(1)分別以0nmol/L、200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L來那度胺干預(yù)細(xì)胞24h，CRBN基因的表達(dá)水平分別為1、0.81±0.02、0.52±0.01、0.23±0.02。試驗中CRBN基因表達(dá)量呈劑量依賴性，隨藥物濃度的增加，表達(dá)量降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)(Fig.7，F(xiàn)ig.8，Table5)。(2)分別以0nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L硼替佐米干

12、預(yù)細(xì)胞24h，CRBN基因的表達(dá)水平分別為1、0.39±0.03、0.17±0.02、0.09±0.02。試驗中CRBN基因表達(dá)量呈劑量依賴性，隨藥物濃度的增加，表達(dá)量降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)(Fig.9，F(xiàn)ig.10，Table6)。
　　4、來那度胺及硼替佐米對CRBN蛋白表達(dá)的影響。Western Blot結(jié)果顯示:(1)分別以0nmol/L、200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L來那度胺干預(yù)

13、細(xì)胞24h，CRBN蛋白的表達(dá)水平分別為1.48±0.03、1.14±0.01、0.95±0.01、0.56±0.02。試驗中CRBN蛋白表達(dá)量呈劑量依賴性，隨藥物濃度的增加，表達(dá)量降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)(Fig.11，Table7)。(2)分別以0nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L硼替佐米干預(yù)細(xì)胞24h，CRBN蛋白的表達(dá)水平分別為1.39±0.1、1.32±0.1、1.36±0.2、1.3

14、4±0.2。試驗結(jié)果表明硼替佐米對CRBN蛋白的表達(dá)無影響，無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.92)(Fig.12，Table8)。
　　結(jié)論:
　　1、來那度胺對骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226的抑制作用呈劑量依賴性，隨藥物濃度的升高，抑制率升高。硼替佐米對骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226的抑制作用呈劑量依賴性，隨藥物濃度的升高，抑制率升高。
　　2、來那度胺對骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226促凋亡作用呈劑量依賴性，隨藥物濃度的增高，凋亡率增高。

15、硼替佐米對骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226促凋亡作用呈劑量依賴性，隨藥物濃度的增高，凋亡率增高。
　　3、來那度胺對骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226的CRBN基因的表達(dá)有抑制作用，呈劑量依賴性，隨藥物濃度的增高，表達(dá)量降低。硼替佐米對骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226的CRBN基因的表達(dá)有抑制作用，呈劑量依賴性，隨藥物濃度的增高，表達(dá)量降低。
　　4、來那度胺對骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226的CRBN蛋白的表達(dá)有抑制作用，呈劑量依賴性，隨藥物濃度的