題目一：p53-HDM2相互作用的非肽小分子抑制劑syl-155對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用;題目二：Stefin A在食管鱗癌組織和細(xì)胞中作用的初步研究.pdf

1、第一部分p53-HDM2相互作用的非肽小分子抑制劑syl-155對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用 p53是一個(gè)強(qiáng)力抗腫瘤活性的抑癌蛋白。在許多人類腫瘤，p53被失活，有多種機(jī)制參與失活p53。其中一個(gè)機(jī)制是癌蛋白MDM2(在人為HDM2)與之結(jié)合，并將其降解。在p53和MDM2蛋白之間形成一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)。5％-10％的人類腫瘤中HDM2蛋白過表達(dá)使p53失活。通過抑制腫瘤細(xì)胞中p53與MDM2的相互作用進(jìn)而激活p53蛋白功能已成為尋找癌癥

2、藥物治療的熱點(diǎn)。已有多個(gè)研究從不同的方面證實(shí)了這種方法的可行性，這些研究包括：顯微注射單克隆抗體，反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染，表達(dá)p53肽類似物或融合蛋白，以及微生物提取物等。然而，除反義寡核苷酸外，它們都是肽類或大分子物質(zhì)，成本較高，不利于新藥開發(fā)和應(yīng)用。因而，發(fā)展非肽類小分子MDM2拮抗劑就成為一個(gè)方向。 基于p53-HDM2蛋白復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的闡明，利用計(jì)算機(jī)輔助模型設(shè)計(jì)并用化學(xué)方法合成了一系列非肽小分子的HDM2抑制劑，我室已畢業(yè)

3、的趙劍華博士采用ELISA方法評(píng)價(jià)了它們與MDM2的親和性，其中一部分能從p53與MDM2的相互作用中釋放p53，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究評(píng)價(jià)了趙劍華博士尚未研究的非肽類小分子的HDM2抑制劑。采用MTT法，獲得它們?cè)?種不同腫瘤細(xì)胞的IC50，以IC50＜10μg/mL作為篩查標(biāo)準(zhǔn)，最后確定syl-155進(jìn)一步研究。采用MTT法、蛋白印跡和流式細(xì)胞分析檢測(cè)了syl-155對(duì)三種不同p53狀態(tài)腫瘤細(xì)胞的影響：KYSE510(人食管鱗癌細(xì)

4、胞系)(突變型p53)、HT1080(人纖維肉瘤細(xì)胞系)(野生型p53)、MG63(人骨肉瘤細(xì)胞系)(p53缺失)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，syl-155僅在表達(dá)野生型p53的HT1080細(xì)胞中刺激p53和p21的積聚，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯或凋亡；而在表達(dá)突變型p53的KYSE510和p53缺失的MG63中則沒有觀察到這些影響。因此，可以得出這樣的結(jié)論：非肽類小分子HDM2抑制劑可能用于表達(dá)野生型p53腫瘤的治療。 第二部分StefinA在

5、食管鱗癌組織和細(xì)胞中作用的初步研究 惡性腫瘤最重要的特征在于能侵襲周圍組織并發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移通常是造成腫瘤患者死亡的主要原因。組織蛋白酶B參與腫瘤從非惡性狀態(tài)進(jìn)展到惡性狀態(tài)，以及腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成。作為組織蛋白酶B的內(nèi)源性抑制劑，stefinA表達(dá)水平與腫瘤惡性進(jìn)展的逆向關(guān)系的報(bào)道越來越多。本研究的目的是分析stefinA在人食管鱗癌組織和細(xì)胞中的作用，并進(jìn)一步評(píng)價(jià)stefinA用于腫瘤治療的可能性。對(duì)62例

6、配對(duì)食管鱗癌組織標(biāo)本的免疫組織化學(xué)和半定量RT-PCR分析表明，與配對(duì)正常食管粘膜上皮組織相比，stefinA表達(dá)明顯下調(diào)，這與以往的cDNA微陣列的分析結(jié)果一致。共聚焦成像分析證實(shí)了stefinA和組織蛋白酶B的共定位。隨后，我們穩(wěn)定轉(zhuǎn)染stefinAcDNA到人EC9706食管鱗癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變大，生長(zhǎng)減慢，組織蛋白酶B活性明顯降低，Matrigel侵襲被明顯抑制，與Matrigel的粘附得到增強(qiáng)，緩解了順鉑誘導(dǎo)的凋亡。同時(shí)，也評(píng)

7、價(jià)了組織蛋白酶B特異性抑制劑CA074Me對(duì)EC9706細(xì)胞的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10μMCA074Me也明顯抑制了EC9706細(xì)胞的組織蛋白酶B活性和Matrigel侵襲。聯(lián)合10μM的CA074Me與stefinA轉(zhuǎn)染進(jìn)一步降低了組織蛋白酶B的活性和抑制了Matrigel侵襲。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)stefinA延緩了EC9706細(xì)胞在裸鼠的增殖；在裸鼠接種的腫瘤中明顯減低Ⅷ因子染色強(qiáng)度，抑制了腫瘤血管的生成；完全抑制了EC9706細(xì)胞在