糖尿病大鼠早期內(nèi)皮功能障礙與oxLDL-LOX-1和NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系及其干預(yù)研究.pdf

1、研究背景和目的： 本研究以鏈脲佐菌素誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠模型，在造模成功后即給予?；撬岣深A(yù)，并同胰島素治療做比較，通過在體直接檢測(cè)糖尿病大鼠早期血管內(nèi)皮的超微結(jié)構(gòu)改變和功能狀態(tài)改變，同時(shí)從分子生物學(xué)水平檢測(cè)循環(huán)中或主動(dòng)脈血管內(nèi)皮oxLDL、LOX-1、NF-κBp65及ICAM-1的表達(dá)水平，初步探討oxLDL/LOX-01系統(tǒng)及NF-κB信號(hào)通路在糖尿病早期血管內(nèi)皮功能障礙中的作用，以及牛磺酸對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮的保護(hù)作用與可能機(jī)制

2、。 研究方法： 1.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓胺纸M：選用8周齡SPF級(jí)雄性wistar大鼠65只，體重180～200g，隨機(jī)取出16只作為正常對(duì)照組，其余給予一次性腹腔注射STZ60mg/kg誘導(dǎo)1型糖尿病模型，注射STZ72h后尾靜脈取血檢測(cè)血糖≥16.7mmol/L、尿糖+++以上者表示造模成功。 2.檢測(cè)指標(biāo)及方法 ①體重和血糖：每周測(cè)量一次體重和空腹血糖，血糖采用One TouchⅡ血糖儀檢測(cè)。 ②

3、外周血指標(biāo)的檢測(cè)：外周血甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)；血清可溶性ICAM-1、oxLDL水平采用Elisa方法檢測(cè)；血清NO水平采用硝酸還原酶比色法檢測(cè)；血漿內(nèi)皮素含量采用放射免疫法檢測(cè)。 ③離體胸主脈環(huán)內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)：大鼠處死取血后，立即游離胸主動(dòng)脈，剪取最上段約3～5mm主動(dòng)脈環(huán)檢測(cè)不同濃度乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)，計(jì)算并繪制log Ach濃度依賴的血管舒張曲

4、線，Rmax代表Ach誘導(dǎo)的血管環(huán)舒張最大百分比，直線回歸方程計(jì)算EC50。 ④血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)觀察：胸主動(dòng)脈組織依次經(jīng)戊二醛、鋨酸固定、脫水、包埋，甲苯胺蘭超薄切片后行透射電鏡鈾--鉛雙重染色，觀察主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 ⑤主動(dòng)脈壁LOX-1、NF-κBp65、ICAM-1蛋白的組織表達(dá)：冰凍切片免疫熒光染色法定性檢測(cè)胸主動(dòng)脈血管壁LOX-1蛋白的表達(dá)；石蠟切片免疫組化SP法檢測(cè)胸主動(dòng)脈血管壁NF-κBp6

5、5、ICAM-1蛋白的表達(dá)。 ⑥Western blot方法定量分析LOX-1、NF-κ Bp65在主動(dòng)脈壁的蛋白含量：提取主動(dòng)脈組織標(biāo)本的蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)變性、電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后，先后加入稀釋的LOX-1、NF-κ Bp65--抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育，經(jīng)ECL顯影、凝膠成像分析系統(tǒng)掃描蛋白條帶進(jìn)行光密度分析。以β-actin作為內(nèi)參，以目的蛋白/β-actin蛋白條帶吸光度值作為蛋白表達(dá)強(qiáng)度。 ⑦逆轉(zhuǎn)錄--

6、聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測(cè)LOX-1、NF-κ Bp65、ICAM-1 mRNA在主動(dòng)脈血管壁的表達(dá)水平：提取各組主動(dòng)脈總RNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、成像分析。分別以LOX-1，NF-κBp65，ICAM-1與β-actin擴(kuò)增條帶吸光度比值作為其mRNA表達(dá)強(qiáng)度。 3.統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包，統(tǒng)計(jì)資料用x±s描述，組間數(shù)據(jù)分析之前先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性指標(biāo)進(jìn)行

7、單因素方差分析及兩兩比較Q檢驗(yàn)，方差不齊的指標(biāo)進(jìn)行獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)及兩兩比較；部分變量間相關(guān)性分析采用Person相關(guān)性分析與Partial相關(guān)分析。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1.一般情況及體重、血糖的變化：與正常對(duì)照組比較，所有糖尿病大鼠血糖明顯升高，并一直維持于高水平狀態(tài)，且體重增長(zhǎng)緩慢，明顯低于正常對(duì)照組大鼠；胰島素治療組大鼠血糖控制理想，體重增長(zhǎng)理想，同正常對(duì)照組比較差異不明顯；?；撬岣深A(yù)對(duì)

8、糖尿病大鼠體重、血糖無(wú)明顯改善。 2.血脂水平的變化：同正常對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠2周時(shí)血脂變化不明顯，6周時(shí)出現(xiàn)血TC、TG、LDL的明顯升高；胰島素治療組血脂指標(biāo)明顯改善，TC、TG、LDL降至正常水平，?；撬岣深A(yù)組大鼠TC、TG水平明顯下降，但與正常對(duì)照組比較仍有差異. 3.外周血oxLDL、NO、ET及sICAM-1水平的變化：糖尿病組2周時(shí)，大鼠血清oxLDL、NO和血漿ET水平出現(xiàn)升高，6周時(shí)血清oxLDL

9、、sICAM-1及血漿ET水平明顯升高，同時(shí)伴隨著血清NO水平及NO/ET值的明顯降低，同正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同糖尿病組比較，胰島素治療組和?；撬岣深A(yù)組血清oxLDL水平明顯降低，但與正常對(duì)照組比較仍有差異。 4.胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化：正常大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜表面平整，內(nèi)皮細(xì)胞扁平狀，排列規(guī)則，細(xì)胞器形態(tài)數(shù)量正常，胞核規(guī)則；糖尿病2周時(shí)，內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)變化不明顯，6周時(shí)內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)變化明顯，出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、

10、部分脫落，基底板部分?jǐn)嗔?，?nèi)皮細(xì)胞微絨毛消失、線粒體嵴突模糊，高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、核周池?cái)U(kuò)張、核皺縮變形等改變。 5.離體血管Ach誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)的變化。 6.主動(dòng)脈血管壁LOX-1蛋白的表達(dá)： 6.1免疫熒光染色法定性檢測(cè)主動(dòng)脈血管壁LOX-1蛋白的組織表達(dá)：正常對(duì)照組及糖尿病2周時(shí)大鼠主動(dòng)脈血管壁基本未見或極少LOX-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，而6周時(shí)糖尿病大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮層可見明顯的亮綠色熒光染色信號(hào)；胰

11、島素和?；撬岣深A(yù)組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮層的亮綠色熒光染色信號(hào)均明顯減弱減少。 6.2 Western Blot定量分析主動(dòng)脈血管壁LOX-1蛋白表達(dá)量：ECL顯影結(jié)果及以β-actin蛋白表達(dá)為參照，圖像系統(tǒng)定量分析結(jié)果顯示，各組腹主動(dòng)脈壁LOX-1在蛋白水平上均有表達(dá)，正常對(duì)照組和糖尿病2周時(shí)LOX-1蛋白表達(dá)水平極低，而糖尿病6周時(shí)LOX-1蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組；胰島素、?；撬岣深A(yù)組LOX-1蛋白表達(dá)水平明顯降低，同糖尿

12、病組比較差異明顯，其中胰島素組LOX-1蛋白水平下降最明顯，但與正常對(duì)照組比較仍有差異。 7.主動(dòng)脈血管壁NF-κ Bp65蛋白的表達(dá) 7.1免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)NF-κ Bp65蛋白的組織表達(dá)：NF-κ Bp65在所有大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮層及肌層均有陽(yáng)性表達(dá)，正常對(duì)照組和2周時(shí)糖尿病組表達(dá)很弱，僅極少內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞漿內(nèi)有稀疏淡染棕黃色染色顆粒；6周時(shí)糖尿病大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞內(nèi)均可見有密集的棕黃色陽(yáng)性染色顆

13、粒，內(nèi)皮層細(xì)胞核內(nèi)亦出現(xiàn)棕色陽(yáng)性染色顆粒；胰島素治療組和?；撬岣深A(yù)組內(nèi)皮層及平滑肌細(xì)胞均著色較淺，細(xì)胞核內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)亦明顯減弱減少。 7.2 Western Blot定量分析胸主動(dòng)脈血管壁NF-κBp65蛋白的表達(dá)水平：顯影結(jié)果及圖像系統(tǒng)定量分析顯示，各組胸主動(dòng)脈壁NF-κBp65蛋白均有表達(dá)，正常對(duì)照組和糖尿病2周時(shí)蛋白條帶顯影很弱，蛋白表達(dá)水平很低；糖尿病6周時(shí)蛋白條帶顯影較強(qiáng)，蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組；胰島素治療、

14、?；撬岣深A(yù)組NF-κBp65蛋白表達(dá)水平明顯降低，同糖尿病組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中胰島素治療組NF-κ Bp65蛋白表達(dá)水平降至接近正常水平。 8.胸主動(dòng)脈血管壁ICAM-1蛋白的表達(dá)水平 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)ICAM-1蛋白在主動(dòng)脈壁的表達(dá)部位，計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性染色平均積分光密度值作為ICAM-1蛋白表達(dá)水平顯示：ICAM-1主要表達(dá)于大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮層細(xì)胞。 9.RT-PCR定量檢

15、測(cè)主動(dòng)脈血管壁LOX-1，NF-κ Bp65，ICAM-1 mRNA表達(dá)水平。 10.相關(guān)性分析：糖尿病大鼠血清oxLDL與NO水平、Rmax、NO/ET比值負(fù)相關(guān)，與血漿ET、血清sICAM-1水平正相關(guān)；主動(dòng)脈內(nèi)皮最大舒張Rmax與ET、oxLDL、sICAM-1水平負(fù)相關(guān)，與NO、NO/ET正相關(guān)，二者均與血糖水平無(wú)明顯相關(guān)性。 研究結(jié)論： 1.糖尿病早期即可出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能及超微結(jié)構(gòu)損傷，內(nèi)皮依賴性血管舒

16、張反應(yīng)是最直接最敏感的內(nèi)皮功能損傷檢測(cè)指標(biāo)；外周血NO、ET、NO/ET和sICAM-1水平可作為篩查內(nèi)皮功能障礙的早期間接指標(biāo)。 2.糖尿病早期存在過強(qiáng)的LDL氧化修飾，oxLDL是誘導(dǎo)糖尿病早期血管內(nèi)皮功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因子；外周血oxLDL水平可作為糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。 3.糖尿病早期血管內(nèi)皮功能損傷，同步發(fā)生了主動(dòng)脈血管壁LOX-1蛋白和基因表達(dá)上調(diào)，且與血清oxLDL水平密切相關(guān)，表明oxLD

17、L與LOX-1相互作用介導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷，oxLDL/LOX-1系統(tǒng)是誘導(dǎo)糖尿病早期血管內(nèi)皮功能障礙的重要分子因素。 4.糖尿病早期主動(dòng)脈壁NF-κ Bp65表達(dá)明顯增強(qiáng)，并伴有明顯核轉(zhuǎn)位，且其基因表達(dá)與LOX-1，ICAM-1mRNA表達(dá)正相關(guān)，提示糖尿病大鼠早期主動(dòng)脈壁NF-κ B激活，NF-κ B信號(hào)通路活化誘導(dǎo)內(nèi)皮黏附因子ICAM-1表達(dá)參與了oxLDL/LOX-1誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷過程。 5.胰島素嚴(yán)格控制血糖對(duì)糖尿