未折疊蛋白反應(yīng)在小鼠再灌注肺凋亡中的作用和機(jī)制.pdf

1、目的:
　　探討未折疊蛋白反應(yīng)在再灌注肺凋亡中的作用，并分析其可能機(jī)制。
　　方法:
　　采用C57BL/6J小鼠在體單側(cè)肺原位缺血再灌注損傷模型。實(shí)驗(yàn)小鼠70只，隨機(jī)分為7組，每組10只:假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、PBS+ Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑組（I/R+PBS+Lipo組）、陰性對(duì)照組(I/R+siRNASCR組)、 I/R+siRNACHOP組，I/R+siRNA

2、caspase-12組，I/R+siRNAJNK組。Sham組:只開(kāi)胸不夾閉肺門(mén)，觀察3.5 h后處死并取左肺;I/R組缺血30 min，再灌注3 h;I/R+PBS+Lipo組:給予PBS溶液和Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑，余同I/R組;I/R+siRNASCR組:給予PBS溶液、Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑和Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑包裹的無(wú)關(guān)序列的siRNA（能進(jìn)入RNAi途

3、徑，但無(wú)干擾作用），余同I/R組;I/R+siRNA組:給予PBS溶液、Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑和Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑包裹的不同目的siRNA，余同I/R組。于實(shí)驗(yàn)前2天通過(guò)鼻飼法干擾小鼠。各組小鼠被處以安樂(lè)死，取左肺組織，進(jìn)行肺組織光鏡檢測(cè)，檢測(cè)總肺水含量(TLW)、肺濕干重比(W/D)和肺泡細(xì)胞損傷定量指標(biāo)(IQA)，分別用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白免疫印跡法檢測(cè)CHOP、cas

4、pase-12、JNK基因水平的表達(dá)以及蛋白含量，通過(guò)電鏡觀察肺組織學(xué)改變，通過(guò)原位缺口末端標(biāo)記法在顯微鏡下觀察肺組織凋亡細(xì)胞。
　　結(jié)果:
　　1.Sham組W/D、TLW及IQA值較之其他組有顯著性差異(P＜0.05)，為所有組中濕干重比值最低。經(jīng)CHOP-siRNA、caspase-12-siRNA、JNK-siRNA干預(yù)后，I/R+siRNACHOP組、I/R+siRNAcaspase-12組、I/R+siRNAJN

5、K組W/D、TLW及IQA值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);
　　2.Sham組肺泡細(xì)胞無(wú)腫脹，結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)未見(jiàn)炎性細(xì)胞漏出，無(wú)水腫滲出、增厚。I/R組、I/R+PBS+Lipo組和I/R+SCR組肺泡細(xì)胞腫脹、結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間質(zhì)水腫、增厚，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)滲出、紅細(xì)胞漏出及炎性細(xì)胞漏出。與之相比，I/R+siRNACHOP組、I/R+siRNAcaspase-12組、I/R+siRNAJNK組肺泡結(jié)構(gòu)的紊亂程度減輕，可見(jiàn)

6、較完整的形態(tài)，肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)滲出減輕及炎性細(xì)胞較之減少;
　　3.Sham組毛細(xì)血管基底膜無(wú)破壞，內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)腫脹，結(jié)構(gòu)完整清楚，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體無(wú)腫脹，微絨毛豐富，板層小體數(shù)量未見(jiàn)減少。I/R組、I/R+PBS+Lipo組和I/R+SCR組細(xì)胞細(xì)胞膜上微絨毛減少或消失，胞漿濃縮，板層體減少、排空增多，線粒體腫脹，細(xì)胞核固縮并邊集在核膜下，可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)附著在毛細(xì)血管內(nèi)壁及肺泡隔上。與上述3組相比，I/R+siRNA

7、CHOP組、I/R+siRNAcaspase-12組、I/R+siRNAJNK組肺組織在電鏡下可見(jiàn)損傷減輕，肺泡結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu)清晰可辨，核染色質(zhì)較均勻，胞漿增多，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表面微絨毛較多，板層小體數(shù)量增多，線粒體腫脹減輕;
　　4.與Sham組相比I/R組、I/R+PBS+Lipo組和I/R+SCR組中的CHOP、caspase-12、JNK基因及CHOP、caspase-12、p-JNK蛋白水平均明顯表達(dá)(P＜0.01)。I

8、/R組、I/R+PBS+Lipo組和I/R+SCR組相比，CHOP、caspase-12、JNK分別在對(duì)應(yīng)的I/R+siRNACHOP組、I/R+siRNAcaspase-12組、I/R+siRNAJNK組中，其基因表達(dá)量和蛋白水平均下降(P＜0.05或P＜0.01);
　　5.與Sham組相比，I/R組、I/R+PBS+Lipo組和I/R+SCR組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多， AI亦均明顯升高(P＜0.01);各組兩兩比較，AI均無(wú)明

9、顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與I/R+PBS+Lipo組和I/R+SCR組相比，I/R+siRNACHOP組、I/R+siRNAcaspase-12組、I/R+siRNAJNK組細(xì)胞凋亡減少，AI均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　I/R引起小鼠肺組織細(xì)胞發(fā)生過(guò)度的UPR，并通過(guò)UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起細(xì)胞凋亡，損傷肺組織;抑制CHOP、caspase-12、JNK凋亡途徑可減輕PIRI