控制性葉酸剝奪法誘導(dǎo)小鼠iPS細(xì)胞的研究.pdf

1、第一部分MEF細(xì)胞葉酸剝奪培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)的研究
　　目的：研究在葉酸剝奪條件下,小鼠胚胎成纖維(mouseembryonicfibroblast,MEF)細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)重編程相關(guān)的多能性基因表達(dá)情況,了解葉酸是否參與細(xì)胞重編程過程。
　　方法：分別用葉酸剝奪培養(yǎng)基和含正常濃度葉酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)MEF細(xì)胞,分別在第3,6,9天比較兩者在多能性基因的甲基化狀態(tài)和多能性基因表達(dá)方面的變化。
　　結(jié)果：葉酸剝奪培養(yǎng)條件下,ME

2、F細(xì)胞的多能性基因(Oct4和Nanog)啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生去甲基化,相應(yīng)的多能性基因表達(dá)增加。
　　結(jié)論：葉酸缺乏可促進(jìn)細(xì)胞多能性基因Oct4和Nanog的表達(dá),葉酸參與細(xì)胞的重編程過程,葉酸缺乏有利于細(xì)胞重編程的進(jìn)行。
　　第二部分 葉酸剝奪條件下四因子重編程MEF細(xì)胞為iPS細(xì)胞的研究
　　目的：研究葉酸剝奪條件下利用4因子誘導(dǎo)小鼠多潛能干(inducedpluripotentstem,iPS)細(xì)胞的誘導(dǎo)效率,優(yōu)化iP

3、S細(xì)胞誘導(dǎo)體系。
　　方法：1)根據(jù)第一部分的結(jié)果,葉酸剝奪條件下培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維(mouseembryonicfibroblast,MEF)細(xì)胞3天作為實(shí)驗(yàn)組;同時(shí)用含葉酸培養(yǎng)基培養(yǎng)MEF細(xì)胞3天作為對(duì)照組。2)然后利用經(jīng)典4因子對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行重編程,并對(duì)所得的誘導(dǎo)iPS細(xì)胞進(jìn)行鑒定,兩組誘導(dǎo)效率進(jìn)行比較;及對(duì)實(shí)驗(yàn)組獲得的iPS細(xì)胞進(jìn)行核型分析。
　　結(jié)果：葉酸剝奪條件下培養(yǎng)的MEF細(xì)胞,經(jīng)典4因子誘導(dǎo)體系的誘導(dǎo)效率較對(duì)

4、照組提高5倍(0.05％vs0.01%),獲得的iPS細(xì)胞保持未分化狀態(tài),多能性標(biāo)記物檢測(cè)均為陽(yáng)性,核型分析結(jié)果示正常細(xì)胞核型。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證明了葉酸剝奪法可在不增加致癌性的前提下提高小鼠iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率,為將來的iPS細(xì)胞的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分 葉酸剝奪條件下三因子誘導(dǎo)小鼠iPS細(xì)胞的研究
　　目的：葉酸剝奪條件下,利用三因子進(jìn)行小鼠iPS細(xì)胞的誘導(dǎo),減少致癌因子,優(yōu)化iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)體系。

5、>　　方法：1)葉酸剝奪條件下培養(yǎng)3天的小鼠胚胎成纖維(mouseembryonicfibroblast,MEF)細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組;同時(shí)以含葉酸培養(yǎng)基培養(yǎng)3天的MEF細(xì)胞作為對(duì)照組;2)以兩組細(xì)胞為靶細(xì)胞,利用Oct4,Klf4和Sox2三種因子進(jìn)行iPS細(xì)胞誘導(dǎo),并對(duì)誘導(dǎo)獲得的iPS細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：葉酸剝奪培養(yǎng)后的MEF細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可獲得iPS細(xì)胞,誘導(dǎo)效率約為0.01%,并對(duì)其鑒定結(jié)果示其AP,Oct4,SSEA-1染色