人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞初始接種密度對(duì)成骨誘導(dǎo)分化影響的初步研究.pdf

1、目的：研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、原代培養(yǎng)，擴(kuò)增純化、流式細(xì)胞儀細(xì)胞表型鑒定，以及對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞初始接種密度對(duì)成骨誘導(dǎo)分化影響等生物特性的初步研究，為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組織工程研究進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴取材無(wú)菌條件下取湘雅醫(yī)院手術(shù)室婦產(chǎn)科健康孕婦足月剖腹產(chǎn)臍帶組織標(biāo)本15份，于手術(shù)室內(nèi)無(wú)菌條件下解剖去除臍帶動(dòng)靜脈，無(wú)菌PBS洗去積血，放入事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基送至湘雅醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞房備

2、用。⑵人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定：在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將準(zhǔn)備好的臍帶組織剪碎至1mm3組織塊，采用Ⅱ型膠原蛋白酶消化法培養(yǎng)原代細(xì)胞。待原代細(xì)胞培養(yǎng)成功，流式細(xì)胞技術(shù)鑒定細(xì)胞表型。⑶人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)，及其生長(zhǎng)曲線繪制。原代細(xì)胞培養(yǎng)、并鑒定后，傳代培養(yǎng)至第3代時(shí)，采用臺(tái)盼藍(lán)染色記數(shù)活細(xì)胞數(shù)量，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，活細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。⑷不同細(xì)胞接種密度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)：將第3代細(xì)胞以三種不同接種密

3、度(1×105/ml，1×106/ml，1×107/ml)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)18天，其中每種細(xì)胞長(zhǎng)滿后，記錄每組收獲細(xì)胞總數(shù)量及培養(yǎng)時(shí)間分別繪制生長(zhǎng)曲線。⑸初始接種細(xì)胞密度對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化的作用研究：將第3代細(xì)胞按前述三種接種密度分組接種至細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液含1.0×10-7mol/L地塞米松，50mg/L抗壞血酸，50mg/L維生素C，1.0×10-3mol/Lβ-甘油磷酸鈉及DMEM/

4、高糖培養(yǎng)基。鑒定誘導(dǎo)分化后成骨細(xì)胞采用(1)堿性磷酸酶試劑盒染色法。所有結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用SPSS.17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間差異性比較在方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析(ANOVA-LSD)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①來(lái)源于人臍帶Wharton’s jelly膠的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)貼壁后表現(xiàn)為間充質(zhì)樣的細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞呈成纖維樣細(xì)胞形態(tài)。②第3，5

5、，7代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本相同。生長(zhǎng)共同特性：細(xì)胞接種后24小時(shí)內(nèi)貼壁，傳代培養(yǎng)潛伏期約為24-36小時(shí)；傳代培養(yǎng)對(duì)數(shù)增殖期約為3-5天，在該階段細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，增勢(shì)迅速，持續(xù)4～5d；對(duì)數(shù)增殖期結(jié)束后4-5天，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期。③表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的抗原CD105，CD44，不表達(dá)造血干細(xì)胞抗原CD34，CD45，與源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞一致，只是來(lái)源不同。④不同初始接種密度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨誘導(dǎo)分化差異顯著(p<0.05)，1×