美國白蛾核型多角體病毒及其感病寄主檢測方法的研究.pdf

1、從多方面研究了美國白蛾核型多角體病毒(Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus，HcNPV)。內(nèi)容包括：HcNPV形態(tài)特征、美國白蛾幼蟲的感染HcNPV的病理過程、美國白蛾幼蟲對病毒的敏感性、病毒對寄生性天敵昆蟲白蛾周氏嚙小蜂的影響、建立了熒光定量PCR和ELISA分析技術(shù)檢測核型多角體病毒的方法，并對病毒在幼蟲體內(nèi)增殖動態(tài)進行了定量檢測。主要研究內(nèi)容和取得的結(jié)果如下： 1、利用電子顯微鏡進行觀

2、察，發(fā)現(xiàn)美國白蛾核型多角體具有多種形態(tài)：有的為三角形、四角形、也有五角型、六角型的，直徑大小為0.8～2μm；為多粒子包埋型，囊膜大小為0.4～0.6μm×0.57～1.11μm；囊膜內(nèi)病毒粒子的數(shù)目一般4-12個。 2、測定了美國白蛾2～5齡幼蟲對HcNPV的敏感性。2齡幼蟲對HcNPV敏感性最高，5齡幼蟲對病毒敏感性最低。幼蟲感染病毒后，其半數(shù)致死濃度LC<,50>值隨著幼蟲齡期的增加而增大；3齡、4齡和5齡幼蟲的LC<,5

3、0>值分別是2齡幼蟲的14倍、105倍和3500倍。以每毫克幼蟲體重半數(shù)致死中濃度(毫克體重的LC<,50>值)作為衡量幼蟲對病毒敏感程度的指標(biāo)，則2齡幼蟲對病毒的敏感性分別是3齡、4齡和5齡幼蟲的3.3倍、4.5倍和59.7倍。在相同齡期內(nèi)，幼蟲感染病毒后半數(shù)死亡時間隨感染劑量的下降而升高。2齡幼蟲在感染劑量為5.3×10<'5>PIBs/mL、5.3×10<'4>PIBs/ mL、5.3×10<'3>PIBs/ mL時，LT<,50

4、>值分別為4.6天、6天、8.8天；5齡幼蟲在感染劑量為5.3×10<'8>PIBs/mL、5.3×10<'7>PIBs/mL時，LT<,50>值分別為12天、14.2天；而在相同劑量下，半數(shù)死亡時間隨著齡期的增加而增加。在感染劑量為5.3×10<'5>PIBs/ mL時，2齡、3齡、4齡幼蟲的LT<,50>值分別為4.6天、11.1天、14.7天，5齡幼蟲在此劑量下，死亡率只有15％。結(jié)論為：美國白蛾幼蟲對其HcNPV的敏感性不僅與幼

5、蟲體重相關(guān)，而且與齡期相關(guān)。 3、美國白蛾幼蟲在接毒后，不同組織細胞隨時間推延而發(fā)生一系列的病理變化。在感染病毒后48h，觀察到中腸細胞核內(nèi)產(chǎn)生淺色的環(huán)狀帶；在感染后120h，體壁真皮細胞發(fā)生異常分裂增生，出現(xiàn)雙層細胞結(jié)構(gòu)；在168h真皮細胞層出現(xiàn)3～4層細胞結(jié)構(gòu)，這是HcNPV感染的特有癥狀；感染后216h，體內(nèi)大部分組織解體，成熟的多角體充滿體腔，幼蟲瀕于死亡。 4、根據(jù)美國白蛾核型多角體病毒的多角體蛋白基因Poly

6、hedrin的保守序列，利用引物設(shè)計軟件Beacon Designer 5.0設(shè)計了特異性引物。用SYBR Green熒光染料法構(gòu)建了標(biāo)準曲線y=-3.450x+36.154，檢測靈敏度為10<'1>～10<'2>copies/μL。建立了快速檢測美國白蛾核型多角體病毒的方法。 5、通過已建立的熒光定量PCR檢測HcNPV多角體蛋白基因Polyhedrin的方法，對感病幼蟲的中腸、血淋巴及整個蟲體進行了檢測。發(fā)現(xiàn)中腸細胞在感病后

7、12～108h內(nèi)，每毫克腸重的Polyhedrin基因拷貝數(shù)在10<'4>～10<'5>copies 范圍內(nèi)波動，在此范圍內(nèi)并沒有呈現(xiàn)出明顯的增高或降低的趨勢；血淋巴樣本Polyhedrin拷貝數(shù)在3～108h內(nèi)呈現(xiàn)增長趨勢，但范圍保持在10<'4>copies/μL之內(nèi)。幼蟲樣本每毫克體重Polyhedrin拷貝數(shù)對數(shù)值與感染時間(h)對數(shù)值呈直線相關(guān)，回歸方程式為：y=3.901x±1.094．(R=0.966，P<0.01)。

8、 6、建立了間接ELISA檢測樣品中的美國白蛾核型多角體的方法，確定兔抗美國白蛾核型多角體病毒最佳抗血清蛋白的含量為53.65μg/mL，美國白蛾病毒液抗原最佳濃度為10<'7>PIBs/mL，最佳封閉條件為0.5％BSA+2％蔗糖封閉37℃水浴2h、4℃24h。美國白蛾病毒抗原的最小檢出量為0.304μg/mL，即1.77x10<'4>PIBs/mL。 7、美國白蛾核型多角體病毒濃度在3.12×10<'5>～1.0×10<

9、'7>PIBs/mL 范圍內(nèi)其對數(shù)值與吸光度OD<,490>呈線性關(guān)系；在死亡前兩天幼蟲體內(nèi)多角體達到平臺期。 8、選取了包括HcNPV在內(nèi)的目前我國利用藥劑防治美國白蛾中有代表性的幾種，模擬林間施藥方式，研究了它們對美國白蛾的重要寄生性天敵—白蛾周氏嚙小蜂Chouioia cunea Yang成蜂安全性。同時研究了HcNPV對白蛾周氏嚙小蜂繁殖的影響。結(jié)果表明：化學(xué)農(nóng)藥對白蛾周氏嚙小蜂成蜂的壽命有顯著影響；仿生農(nóng)藥和生物殺蟲劑