芪術(shù)顆粒對肝纖維化形成過程中P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、1理論研究部分
　　通過對現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究進展及中醫(yī)學(xué)對于肝纖維化研究概況的相關(guān)文獻資料的整理分析，同時結(jié)合本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，進一步探討“化瘀通絡(luò)”法在防治肝纖維化中的具體機制，完善絡(luò)病論治肝纖維化的理論研究。
　　根據(jù)現(xiàn)代的解剖學(xué)知識，肝門靜脈、肝動脈、肝靜脈均有逐級分支，肝竇作為通透性最大的血竇之一，是肝內(nèi)血管的終末分支，是保障血液和肝細胞間正常物質(zhì)交換的組織學(xué)基礎(chǔ)，具有參與物質(zhì)交換、能量交換、信息傳遞的功能。而根據(jù)

2、中醫(yī)理論，絡(luò)脈具有滲灌血氣、互滲津血等獨特的生理功能，是經(jīng)脈中氣血營養(yǎng)臟腑組織的橋梁和樞紐。因此，從肝竇和肝絡(luò)的結(jié)構(gòu)及功能特點來看，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的肝竇及其在肝纖維化過程中發(fā)生的毛細血管化改變可歸屬于中醫(yī)肝絡(luò)及其病變的重要組成部分。
　　2實驗研究部分
　　目的：動態(tài)觀察芪術(shù)顆粒對CCL4所致的肝纖維化形成過程中VEGF介導(dǎo)的p38MAPK信號傳導(dǎo)通路的影響，進一步闡釋芪術(shù)顆粒抗肝纖維化的作用機理，完善從絡(luò)病論治肝纖維化的理論，為

3、“化瘀通絡(luò)法”提供實驗依據(jù)。
　　方法：采用10％CCl4橄欖油腹腔注射建立大鼠肝纖維化模型，同時給予芪術(shù)顆粒灌胃預(yù)防，并設(shè)立正常對照組、實驗對照組、模型對照組，分別于造模的第1w、2w、4w時間點耿大鼠肝組織進行以下觀察。1：于預(yù)定時間點切取100mg(<1cm×1cm)新鮮肝組織置于-80℃的液氮中保存，用Western blot免疫印跡法檢測大鼠肝臟組織中VEGF介導(dǎo)的總p38 MAPK及p-p38 MAPK、總ATF-2及

4、p-ATF-2蛋白的表達量。2：耿肝組織1mm3，迅速置于4℃2.5％的戊二醛固定。經(jīng)過鋨酸、梯度丙酮、環(huán)氧樹脂及醋酸鈾.檸檬酸鉛等固定、包埋、染色。切片。透射電鏡觀察并照相，對肝竇竇壁結(jié)構(gòu)、肝竇內(nèi)皮窗孔數(shù)目、內(nèi)皮下基底膜的形成進行動態(tài)觀察。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠肝組織總p38 MAPK蛋白表達的影響
　　各組大鼠肝組織在1周、2周和4周時間點，總p38 MAPK的蛋白表達量均較強，顯示較濃。
　　1周時，模

5、型對照組、芪術(shù)顆粒組與正常組比較有差異(1.75±0.25vs1.13±0.28，1.68±0.26vs1.13±0.28；p<0.05)；2周時，模型對照組、芪術(shù)顆粒組與正常組比較無差異(1.56±0.44vs1.22±0.26，1.38±0.24vs1.22±0.26；p>0.05)；4周時，模型對照組與正常組、實驗組比較有顯著差異(1.83±0.26vs1.28±0.21，1.83±0.26vs1.38±0.22；p<0.01)。

6、1周、2周時，模型組與芪術(shù)顆粒組之間無差異(1.75±0.25vs1.68±0.26；1.56±0.44vs1.38±0.24；p>0.05)。4周時，模型對照組與芪術(shù)顆粒組之間有差異(1.83±0.26vs1.45±0.35；p<0.05)。
　　正常對照組、實驗對照組、模型對照組和芪術(shù)顆粒組大鼠肝組織總p38 MAPK的蛋白表達量在1周、2周和4周時間點之間比較均無差異(1.13±0.28vs1.22±0.26vs1.28±0

7、.21；1.30±0.26vs1.18±0.31vs1.38±0.22；1.75±0.25vs1.56±0.44vs1.83±0.26；1.68±0.26vs1.38±0.24vsl.45±0.35；p>0.05)。
　　2.芪術(shù)顆粒對大鼠肝組織p-p38 MAPK蛋白表達的影響
　　各組大鼠肝組織中在1周和2周兩個時間點，p-p38 MAPK蛋白微弱表達，顯色極淡。在4周p-p38 MAPK蛋白明顯表達，顯色較濃。

8、　　1周時，模型對照組與正常對照組、實驗對照組比較有差異(0.36±0.11 vs0.21±0.07，0.36±0.11vs0.24±0.07；p<0.05)。2周和4周時，模型對照組與正常對照組、實驗對照組之間比較無差異(0.40±0.12vs0.28±0.12，0.40±0.12vs0.31±0.10，1.51±0.41vs1.15±0.22，1.51±0.41vs1.22±0.13；p>0.05)，1周、2周和4周時三個時間點模型

9、對照組與芪術(shù)顆粒組之間無差異(0.36±0.11vs0.31±0.11，0.40±0.12vs0.37±0.14，1.51±0.41vs1.32+0.45；p>0.05)。
　　實驗對照組、正常對照組、模型對照組及芪術(shù)顆粒組大鼠肝組織P-p38 MAPK的蛋白表達量在4周與1周、2周時間點之間均有顯著差異(1.15±0.22vs0.21±0.07、1.15±0.22vs0.28±0.12；1.22±0.13vs0.24±0.07、

10、1.22±0.13vs0.31±0.10；1.51±0.41vs0.36±0.11、1.51±0.41vs0.40±0.12，1.32±0.45vs0.31±0.11、1.32±0.45vs0.37±0.14，p<0.01)。4組的1周與2周之間無差異(p>0.05)。
　　3.芪術(shù)顆粒對大鼠肝組織總ATF-2蛋白表達的影響
　　各組大鼠肝組織在1周和2周兩個時間點，總ATF-2蛋白微弱表達，顯色極淡。在4周大鼠肝組織中AT

11、F-2蛋白明顯表達，顯色較濃。
　　1周時，模型對照組、芪術(shù)顆粒組與正常對照組比較無差異(0.85±0.21vs0.61±0.14，0.81±0.33vs0.61±0.14；p>0.05)，模型對照組與芪術(shù)顆粒組之間無差異(0.85±0.21vs0.81±0.33，p>0.05)。2周時，模型對照組與正常組、實驗組比較有差異(1.29±0.28vs0.75±0.22，1.29±0.28vs0.92±0.35；p<0.05)，模型對

12、照組與芪術(shù)顆粒組之間無差異(1.29±0.28vs1.13±0.26；p>0.05)。4周時，模型對照組、芪術(shù)顆粒組與正常組比較有顯著差異(1.51±0.26vs1.12±0.21，1.44±0.36vs1.12±0.21；p<0.01)，模型對照組與芪術(shù)顆粒組之間無差異(1.51±0.26vs1.44±0.36；p>0.05)。
　　正常對照組大鼠肝組織總p38 MAPK的蛋白表達量在4周與1周、2周時間點之間比較均有顯著差異(

13、1.12±0.21vs0.61±0.14，1.12±0.21vs0.75±0.22；p<0.01)。芪術(shù)顆粒組和模型對照在1周和4周之間有顯著差異(1.44±0.36vs0.81±0.33，1.51±0.26vs0.85±0.21；p<0.01)。
　　4.芪術(shù)顆粒對大鼠肝組織磷酸化ATF-2蛋白表達的影響
　　各組大鼠肝組織在1、2周兩個時間點，p-ATF-2蛋白微弱表達，顯色極淡。在4周大鼠肝組織中ATF-2蛋白明顯表達

14、，顯色較濃。
　　1周時，模型對照組與正常對照組有顯著差異(0.58±0.14vs0.38±0.14；p<0.01)、與實驗對照組比較有差異(0.58±0.14vs0.38±0.04；p<0.05)。模型對照組與芪術(shù)顆粒組之間無差異(0.58±0.14vs0.55±0.14：p>0.05)。2周時，模型對照組與正常對照組有顯著差異(1.11±0.38vs0.62±0.13；p<0.01)、與實驗對照組比較有差異(1.11±0.38

15、vs0.71±0.25；p<0.05)；模型對照組與芪術(shù)顆粒組之間無差異(1.11±0.38vs0.85±0.35；p>0.05)。4周時，模型對照組、芪術(shù)顆粒組與正常對照組、實驗對照組比較均有差異(1.77±0.41vs1.13±0.38，1.77±0.41vs1.29±0.31；1.38±0.40vs1.13±0.38，1.38±0.40vs1.29±0.31；p<0.05)，模型對照組與芪術(shù)顆粒組之間無差異(1.77±0.41vs

16、1.38±0.40；p>0.05)。
　　實驗對照組、正常對照組、模型對照組及芪術(shù)顆粒組大鼠肝組織p-ATF-2的蛋白表達量在4周與1周、2周時間點之間均有顯著差異(1.13±0.38vs0.38±0.14，1.13±0.38vs0.62±0.13:1.29±0.31vs0.38±0.04，1.29±0.31vs0.71±0.25；1.77±0.41vs0.58±0.14，1.77±0.41vs1.11±0.38；1.38±0.4

17、0vs0.55±0.14，1.38±0.40vs0.85±0.35；p<0.01)。實驗對照組和模型對照組的1周與2周之間比較有差異(0.38±0.04vs0.71±0.25，0.58±0.14vs1.11±0.38；p<0.05)。
　　5.電鏡觀察結(jié)果
　　正常對照組：大鼠肝細胞呈圓形或卵圓形，細胞界限清楚，細胞膜完整光滑，可見膽小管。胞質(zhì)豐富，可見數(shù)量較多的圓形線粒體，嵴清晰，無腫脹。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，表面附著核糖體

18、顆粒，高爾基復(fù)合體及大量散在的糖原顆粒。核膜清晰可見，完整連續(xù)，可見核仁。肝SEC有許多窗孔，在Disse間隙中，有豐富的肝細胞微絨毛及貯脂細胞。
　　實驗對照組：肝臟超微結(jié)構(gòu)的改變與正常組基本相同。
　　模型對照組：大鼠CCL4造模1周后，肝細胞胞漿內(nèi)可見大小不等的脂質(zhì)滴，部分肝細胞呈空泡狀為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重擴張所致，較多的圓形線粒體，嵴清晰，糖原顆粒較正常組少。Disse間隙中有豐富的肝細胞微絨毛，SEC有許多窗孔，外無基膜結(jié)

19、構(gòu)。2周時變化：模型組肝細胞輕度或重度損害，輕度損害者肝細胞胞漿內(nèi)可見大小不等的脂質(zhì)滴，糖原顆粒較正常組少。重度損害者肝細胞呈空泡狀，為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重擴張所致。Disse間隙中可見肝細胞微絨毛，SEC有較多窗孔，內(nèi)皮細胞外無基膜結(jié)構(gòu)，未見膠原纖維增生。4周時，模型組肝細胞胞漿內(nèi)的脂滴融合呈大脂滴，將細胞核擠壓，有核仁出現(xiàn)核固縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重擴張致肝細胞呈空泡狀改變，較多的線粒體內(nèi)室擴張，基質(zhì)變稀，電子密度明顯下降，嵴變得短而少，移至邊緣或發(fā)生

20、斷裂。較多成纖維細胞增生，旁有膠原纖維沉積。Disse間隙中可見肝細胞微絨毛，SEC窗孔較正常組明顯減少，內(nèi)皮細胞外無基膜結(jié)構(gòu)。
　　芪術(shù)顆粒組：大鼠1周時，肝細胞胞漿內(nèi)亦可見大小不等的脂質(zhì)滴，但較模型組少，未見肝細胞空泡狀改變，可見數(shù)量較多的線粒體，嵴清晰，糖原顆粒較多。Disse腔中有豐富的肝細胞微絨毛，肝SEC有許多窗孔，但與模型組比較無明顯差別，內(nèi)皮細胞外無基膜結(jié)構(gòu)；2周時，肝細胞出現(xiàn)輕度損害，胞漿內(nèi)可見大小不等的脂質(zhì)滴，

21、但較模型組少，糖原顆粒較多。Disse腔中有豐富的肝細胞微絨毛，觀察SEC窗孔與模型組無明顯差別，無膠原纖維增生。4周時，肝細胞胞漿內(nèi)可見大小不等的脂質(zhì)滴，部分脂滴融合呈大脂滴，將細胞核擠壓，未見肝細胞空泡狀改變，少量線粒體電子密度明顯下降，可見糖原顆粒，可見成纖維細胞，旁有膠原纖維增生。SEC窗孔較2周時減少，但所見窗孔多于模型組，內(nèi)皮細胞外無基膜結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：
　　芪術(shù)顆?？梢哉{(diào)節(jié)p38 MAPK信號通路，影響總p3