持續(xù)驚厥后大鼠海馬神經干細胞激活反應及相關調控因素研究.pdf

1、第一部分持續(xù)驚厥后大鼠海馬神經再生與凋亡的動態(tài)變化目的：探討驚厥持續(xù)狀態(tài)(status convulsion，SC)后大鼠海馬神經再生與凋亡的動態(tài)變化。 方法：建立成年Wistar鼠30min SC模型，在SC后1天至56天的6個時間點上處死動物，處死前1天均腹腔注射5-溴2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo 2-deoxyuridine，BrdU)；采用免疫組織化學方法動態(tài)檢測BrdU、nestin的表達，確定神經干細胞(neu

2、ral progenitor/stem cells，NPCs)增殖水平；雙重熒光染色標記nestin/TUNEL，確定新生神經干細胞存活狀態(tài)。 結果：正常成年鼠海馬區(qū)，存在少量BrdU陽性細胞；SC后1天，CA1區(qū)和齒狀回的BrdU陽性細胞即開始顯著升高，與對照組相比，BrdU陽性細胞數(shù)目于SC后第7天在CA1區(qū)達增殖高峰，28天降至正常水平；于SC后第28天在齒狀回達增殖高峰，56天降至正常水平；在SC后第7天，CA3區(qū)有大量

3、的BrdU陽性細胞。BrdU和nestin性細胞的空間分布是一致的，陽性數(shù)目無統(tǒng)計學差異；在SC后的前3天，CA1區(qū)新增殖的神經細胞呈TUNEL，陽性；齒狀回新增殖細胞始終表現(xiàn)TUNEL陰性。結論：SC后能激活海馬自體NPCs原位增殖，并且部分新生細胞可能向海馬神經細胞損傷區(qū)域發(fā)生遷移。 第二部分體外培養(yǎng)大鼠海馬神經干細胞的興奮性與電生理特征目的：觀察體外分離培養(yǎng)大鼠海馬神經干細胞(neuralprogenitor/stem c

4、ells，NPCs)的興奮性及電壓門控通道表達。 方法：無血清培養(yǎng)方法體外分離、純化孕15～16天Wistar胎鼠的海馬NPCs，nestin免疫熒光染色及血清促分化檢測NPCs的干細胞特性；以接種于多聚賴氨酸包被玻片上6～24h的第二代NPCs為研究對象，經DiBAC4(3)染色后，用含50μM KCI的細胞外液刺激，激光共聚焦掃描顯微鏡檢測NPCs的膜興奮性；采用膜片鉗電流鉗記錄模式，記錄NPCs的自發(fā)放電和動作電位；采用電

5、壓鉗記錄模式，檢測NPCs的電壓門控離子通道表達。 結果：無血清培養(yǎng)基體外可獲得高純度的海馬NPCs，形成神經球，可傳代培養(yǎng)3～4代；NPCs表達干細胞標記蛋白nestin，且可分化為Tuj-1免疫反應陽性的神經元和GFAP免疫反應陽性的星形膠質細胞；接種于多聚賴氨酸包被的玻片上6～24小時的第二代NPCs仍表現(xiàn)干細胞特性；采用DiBAC4(3)染色，含高濃度鉀的細胞外液刺激后，NPCs膜電位無顯著改變；在電流鉗模式下，未能檢測

6、到NPCs的自發(fā)放電，未能誘發(fā)動作電位；在電壓鉗模式下，未記錄到NPCs的鈉電流，但記錄到到外向延遲整流鉀電流及外向瞬時鉀電流兩種鉀電流。結論：采用無血清培養(yǎng)方法，在體外成功分離大鼠海馬NPCs；大鼠海馬NPCs不易興奮，可能與其僅表達鉀電流而無鈉電流表達有關。第三部分腦源性神經營養(yǎng)因子對海馬神經干細胞存活、增殖及分化的影響目的：探討腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)對海

7、馬神經干細胞(neural progenitor/stern cells，NPCs)的存活、增殖及分化的影響。 方法：采用無血清培養(yǎng)基體外分離、純化、擴增胎鼠海馬NPCs。采用神經球計數(shù)及神經球直徑測定觀察BDNF對神經干細胞有無促增殖作用，并篩選出在適當細胞密度下，促進NPCs增殖的有效濃度；采用TUNEL染色及全自動生化分析儀測定細胞培養(yǎng)上清液乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)的含量探討B(tài)DNF對

8、海馬NPCs存活的影響；采用抗-Tuj-1染色檢測NPCs分化成神經元的百分率，同時測定分化神經元突起的長度。 結果：體外分離培養(yǎng)的海馬NPCs表現(xiàn)為nestin免疫染色陽性，具有自我增殖能力，且能分化為神經元和星形膠質細胞；當細胞密度為5×105個/mL時，10～200ng/mL的BDNF能顯著促進NPCs的增殖，其中40ng/mL的BDNF促增殖作用最強；40ng/mL BDNF能顯著增大神經球直徑，顯著減少NPCs的凋亡率

9、(TUNE+/DAPI+)，抑制LDH漏出。40ng/mL BDNF也能顯著促進NPCs分化為Tuj-1免疫染色陽性神經元，且分化后神經元的突起長度顯著長于對照組。 結論：BDNF促進海馬NPCs的存活、增殖及向神經元方向分化。 第四部分持續(xù)驚厥后海馬內谷氨酸的動態(tài)變化及其對神經干細胞的作用目的：探討驚厥持續(xù)狀態(tài)(status convulsion，SC)后海馬內谷氨酸(glutamate，Glu)含量的動態(tài)變化及其對海馬

10、神經干細胞(neuralprogenitor/stem cells，NPCs)的體外調控作用。 方法：建立SC動物模型，在SC后1～7天內的3個時間點處死動物，高效液相色譜法檢測海馬內Glu含量的動態(tài)變化；體外分離、純化海馬NPCs，采用免疫熒光和Western blot檢測N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)的必需亞單位NR1的表達；采用Fluo-3/A

11、M鈣成像技術及細胞單通道記錄技術研究NPCs表達的NMDAR是否具有一定功能；采用TUNEL染色及全自動生化分析儀測定含不同濃度Glu和MK-801細胞培養(yǎng)上清液乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)的含量，探討NPCs上NMDAR激活是否介導神經興奮毒性作用；采用神經球計數(shù)及神經球直徑測定觀察Glu對NPCs增殖的影響。結果：SC后1天，海馬內的Glu含量即開始升高，在SC后第3天達高峰，SC后第7天降至正常水

12、平；免疫熒光和Western blot的結果均顯示NPCs表達NR1；NMDA刺激后，F(xiàn)luo-3/AM Ca2+成像結果顯示NPCs細胞內游離Ca2+含量明顯升高，單通道細胞貼附式記錄顯示NPCs表達三種形式的電流：典型的單極矩形脈沖式發(fā)放、閃爍現(xiàn)象、爆發(fā)式開放和簇狀開放；在30μM MK-801和0～1600μM Glu共7個實驗組中，1600μM Glu組培養(yǎng)上清液中LDH顯著增高，而其他各組無差別；各組的凋亡水平無顯著差別；在3