影響神經(jīng)干細(xì)胞體外分化后突觸形態(tài)與功能的相關(guān)因素研究.pdf

1、第一部分： 目的：研究胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞（NPCs）體外培養(yǎng)方法、了解其分化及超微結(jié)構(gòu)特點。 方法：分離胎鼠海馬NPCs，應(yīng)用機械分離法將海馬組織制成單細(xì)胞懸液，用含有bFGF和EGF的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代后用含血清培養(yǎng)基促分化，免疫細(xì)胞化學(xué)方法對NPCs及其分化后的子代神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并在電鏡下觀察分化后細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。 結(jié)果：海馬NPCs在無血清培養(yǎng)基中懸浮成球，貼壁后，細(xì)胞逐漸從細(xì)胞球向周圍遷移分化

2、。體外培養(yǎng)胎鼠海馬NPCs表達(dá)巢蛋白（nestin），在體外可誘導(dǎo)分化產(chǎn)生分別表達(dá)Tuj-1和GFAP的神經(jīng)細(xì)胞。電鏡觀察到分化后的神經(jīng)細(xì)胞及突起相互間排列、具有各種細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，可見細(xì)胞間緊密連接，完整的突觸結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：采用無血清培養(yǎng)基中加入特定生長因子的培養(yǎng)技術(shù)，可培養(yǎng)出在體外穩(wěn)定增殖并有多向分化潛能的大鼠胚胎NPCs。 第二部分： 目的：探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）對體外培養(yǎng)的胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞（NP

3、Cs）分化后突觸形態(tài)與功能的影響。 方法：采用無血清培養(yǎng)基體外分離培養(yǎng)胎鼠海馬NPCs，加入含有40 ng/mL的BDNF促分化培養(yǎng)基，以含有2％ B27和1％胎牛血清的DMEM/F12促分化培養(yǎng)基做對照，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，體外誘導(dǎo)分化14 d后，通過免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測突觸囊泡蛋白（SYN）的表達(dá)，采用實時熒光成像技術(shù)在激光掃描共聚焦顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞受50 mmoL/L的高濃度Kcl溶液

4、刺激前后的熒光強度變化。 結(jié)果：分化后的海馬NPCs經(jīng)BDNF處理后證實：免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色及Western blot中SYN蛋白的表達(dá)高于對照組；實時熒光成像技術(shù)顯示突觸循環(huán)功能強度高于對照組。 結(jié)論：BDNF能促進(jìn)海馬NPCs分化后突觸形態(tài)與功能的表達(dá)。 第三部分： 目的：探討星形膠質(zhì)細(xì)胞（AST）對胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞（NPCs）分化后神經(jīng)元電生理特征的影響。 方法：采用無血清培養(yǎng)基體外分離

5、培養(yǎng)胎鼠海馬NPCs，含血清培養(yǎng)基體外分離培養(yǎng)新生鼠海馬AST，免疫細(xì)胞化學(xué)方法對NPCs和AST進(jìn)行鑒定；在共同培養(yǎng)下AST誘導(dǎo)NPCs分化為神經(jīng)元，以促分化培養(yǎng)基和加入含有40 ng/mL的BDNF促分化培養(yǎng)基做對照，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄分化的神經(jīng)元的離子通道、動作電位及突觸后電流等電生理指標(biāo)。 結(jié)果：體外培養(yǎng)胎鼠海馬NPCs表達(dá)巢蛋白（nestin），體外培養(yǎng)新生鼠海馬AST表達(dá)膠質(zhì)纖維蛋白（GFAP）；共同培養(yǎng)條件下