酵母核修飾基因MSS1調(diào)控線粒體15S rRNA C1477G突變相關(guān)的新霉素敏感性及機(jī)制研究.pdf

1、線粒體功能受線粒體基因、核基因以及環(huán)境因素等調(diào)控。酵母線粒體15SrRNAC1477G是人線粒體12SrRNAA1555G的同源突變，A1555G突變被認(rèn)為是氨基糖苷類抗生素誘導(dǎo)及非綜合征耳聾的重要因素之一，但是僅有A1555G突變并不一定導(dǎo)致耳聾發(fā)生，還與核修飾基因、氨基糖苷類抗生素等密切相關(guān)。以前的研究主要針對(duì)單個(gè)因素，或者線粒體基因與核基因、線粒體基因與環(huán)境因素兩者之間的作用，有關(guān)三者間的相互作用及致病機(jī)制尚不明確。
　　

2、 本論文以酵母為模型，利用已構(gòu)建的線粒體15SrRNA野生型(PS)、C1477G突變型(PR)，和/或核修飾基因MSS1野生型(MSS1)、突變型(mss1)四種菌株:MSS1(Ps)、mss1(Ps)、MSS1(PR)、和mss1(PR)，觀察它們?cè)谄咸烟桥囵B(yǎng)基(GYP)中的氨基糖苷類抗生素敏感性。結(jié)果顯示:攜野生型線粒體DNA(PS)時(shí)，MSS1突變與否并不影響酵母菌株的正常生長，即表現(xiàn)為新霉素不敏感性。攜線粒體15SrRNAC1

3、477G突變(PR)時(shí)，MSS1野生型菌株MSS1(PR)的生長受到顯著抑制，即表現(xiàn)為新霉素敏感性;而MSS1突變型菌株mss1(PR)的生長也受到抑制，但抑制程度較低，表現(xiàn)為新霉素敏感性下降。因此，我們提出研究假說:MSS1基因突變降低了酵母mtDNAC1477G突變引起的新霉素敏感性。進(jìn)而深入研究了mtDNAC1477G突變、核修飾基因MSS1和氨基糖甙類抗生素三者間的相互作用，初步揭示其表型表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。主要內(nèi)容如下:
　

4、　 1、攜線粒體15SrRNAC1477G突變菌株表現(xiàn)出新霉素敏感性表型。攜mtDNAC1477G突變的菌株，在含新霉素的葡萄糖培養(yǎng)基中氧氣消耗速率相比在葡萄糖培養(yǎng)基中降低了約60％，有極顯著性變化，表明線粒體功能出現(xiàn)了障礙;另外，在含新霉素的培養(yǎng)基中，菌株糖酵解途徑中(己)糖激酶基因HXK2的表達(dá)顯著性降低，丙酮酸激酶基因PYK1的表達(dá)極顯著性降低，進(jìn)而降低了菌株的糖酵解作用。菌株線粒體功能的障礙和糖酵解作用的降低，使其不能有充足的

5、能量維持生長，從而表現(xiàn)出新霉素敏感性的表型。
　　 2、核修飾基因MSS1突變抑制了線粒體15SrRNAC1477G突變相關(guān)的菌株新霉素敏感性。在含新霉素的葡萄糖培養(yǎng)基中，相比攜mtDNAC1477G突變的菌株的氧氣消耗速率，同時(shí)攜C1477G突變與MSS1基因突變的菌株mss1(PR)氧氣消耗速率降低了約61.6％，有極顯著性變化;線粒體基因的表達(dá)也出現(xiàn)了不同水平的降低，這說明菌株的線粒體功能進(jìn)一步降低。但是，糖酵解途徑三個(gè)關(guān)

6、鍵性激酶基因的mRNA表達(dá)增高，其中PFK1和PYK1基因的表達(dá)極顯著性增高，HXK2的表達(dá)顯著性增高，促進(jìn)了糖酵解作用，產(chǎn)生的能量彌補(bǔ)了線粒體功能缺陷而導(dǎo)致的能量減少，并且維持了菌株生長所需的能量，表現(xiàn)出新霉素不敏感性的表型。另一方面，菌株mss1(PR)新霉素抗性基因NEO1，NEO6和NEO7的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性變化，新霉素的攝入量也沒有顯著變化，這表明新霉素抗性基因的表達(dá)及新霉素的攝取與MSS1基因突變抑制mtDNAC1477G

7、突變相關(guān)的新霉素敏感性無關(guān)。
　　 3、HAP(heme-activatedprotein)復(fù)合體中的HAP5介導(dǎo)mss1(PR)菌株中的糖酵解水平提高。在含新霉素的培養(yǎng)基中，mss1(PR)菌株中HAP復(fù)合體中HAP5的mRNA表達(dá)顯著性增加，上調(diào)了糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄因子GCR1等的表達(dá)，進(jìn)而使糖酵解基因的表達(dá)增加(如糖酵解關(guān)鍵性激酶基因HXK2，PFK1和PYK1)，促進(jìn)其糖酵解作用。通過構(gòu)建HAP5基因敲除及過表達(dá)菌株，相關(guān)