應(yīng)激標(biāo)志物快速檢測技術(shù)用于人體應(yīng)激反應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、現(xiàn)代應(yīng)激概念認(rèn)為:應(yīng)激是一種當(dāng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定受到威脅時,機(jī)體對應(yīng)激源產(chǎn)生特異性和(或)非特異性反應(yīng)。應(yīng)激的啟動以一系列的反應(yīng)體現(xiàn)出來,這些反應(yīng)包括分子水平上的生物化學(xué)反應(yīng),激素水平層面上的調(diào)控以及系統(tǒng)整合方面的行為、情緒和認(rèn)知的變化等等,統(tǒng)稱為應(yīng)激反應(yīng)。應(yīng)激作為發(fā)病機(jī)制已經(jīng)涉及臨床各科,特別是心血管疾病、神經(jīng)精神病、胃腸疾病和內(nèi)分泌疾病等高發(fā)病率的疾病與應(yīng)激密切相關(guān),也對人的學(xué)習(xí)和認(rèn)知過程產(chǎn)生影響。因此眾多研究者一直想把應(yīng)激狀態(tài)客觀地測

2、量出來,以便定量地觀察應(yīng)激過程。由于至今沒有一種方法能全面、準(zhǔn)確地對應(yīng)激狀態(tài)進(jìn)行評估。因此,進(jìn)一步探討應(yīng)激反應(yīng)規(guī)律,不斷改進(jìn)和完善應(yīng)激評估指標(biāo),對準(zhǔn)確測量應(yīng)激反應(yīng)、預(yù)防應(yīng)激對機(jī)體造成的損害有重要意義。目前用于應(yīng)激研究的生化物質(zhì)主要有兒茶酚胺類、糖皮質(zhì)激素(主要是皮質(zhì)醇)、唾液α-淀粉酶。檢測的生物樣本包括組織、腦脊液、血液、尿液、唾液等,對于人體研究,研究報道最多的是血液,然而抽血本身是一種急性應(yīng)激源,亦可能造成人體應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致生化指

3、標(biāo)瞬時變化。近年來唾液樣品的測定在精神神經(jīng)內(nèi)分泌研究中顯得日益重要,唾液.采集無創(chuàng)傷、簡便、易被接受,尤其適合幼兒研究。此外,研究證實(shí)頭發(fā)皮質(zhì)醇是一種研究長期HPA軸活性很好的工具,可以客觀測量慢性應(yīng)激,所以頭發(fā)樣本分析也必將成為生理學(xué)、精神醫(yī)學(xué)、體育醫(yī)學(xué)、認(rèn)知科學(xué)、心理學(xué)等眾多領(lǐng)域的研究手段之一。
　　 本文開展了以下五個主要內(nèi)容的研究工作:(1)唾液中皮質(zhì)醇的高效液相色譜.熒光檢測方法;(2)頭發(fā)中皮質(zhì)醇高效液相色譜.熒光檢

4、測方法:(3)唾液α-淀粉酶含量的流動注射分析方法;(4)尿液中兒茶酚胺選擇性提取高效液相色譜—電化學(xué)檢測方法:(5)人體應(yīng)激實(shí)驗(yàn)生物樣本測定,唾液皮質(zhì)醇和唾液α-淀粉酶兩種應(yīng)激生物標(biāo)志物比較研究。
　　 本課題的研究將為為生理學(xué)、精神醫(yī)學(xué)、體育醫(yī)學(xué)、認(rèn)知科學(xué)、心理學(xué)研究提供知識和技術(shù)支持。
　　 論文主要工作如下:
　　 一、生物樣本中目標(biāo)物前處理方法的研究
　　 采用本實(shí)驗(yàn)室研制的幾種納米纖維作為固相

5、萃取柱的吸附劑,填裝固相微萃取小柱開展了基于納米纖維的固相萃取(Packed-fiber solid-phase extraction,PFSPE)樣品前處理研究,內(nèi)容包括生物樣品中目標(biāo)物的提取和雜質(zhì)凈化去除兩方面的研究:
　　 (1)以聚苯乙烯電紡納米纖維為萃取介質(zhì),分離提取唾液和頭發(fā)浸出液中皮質(zhì)醇,提取回收效率近100％,操作快速、高效。此外,用PFSPE法提取皮質(zhì)醇強(qiáng)酸衍生物,效率遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報道的溶劑提取法,很好的解決了衍

6、生物需要快速與反應(yīng)介質(zhì)分離,確保衍生物穩(wěn)定性的難題,并且克服了文獻(xiàn)報道方法提取回收率低、凈化效果差的缺點(diǎn),不僅使得檢測靈敏度提高、干擾減少,而且提取過程簡便、快速、環(huán)保。
　　 (2)采用合成的聚冠醚與聚苯乙烯高分子混合電紡,制備出一種新型的納米纖維材料,用此材料為萃取介質(zhì)裝填固相萃取小柱,對兒茶酚胺類物質(zhì)進(jìn)行提取分析研究,構(gòu)建了尿液生物樣品中兒茶酚胺類物質(zhì)高效分離、凈化、富集于一體的快速樣品前處理方法。
　　 (3)比

7、較了不同成分納米纖維和脫脂棉去除唾液中粘性物質(zhì)的效率,掌握了用PFSPE方法去除大分子粘性物質(zhì)的方法,為實(shí)現(xiàn)唾液樣品自動化前處理研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、優(yōu)化柱前衍生化—高效液相色譜法,建立唾液和頭發(fā)中皮質(zhì)醇的測定方法
　　 皮質(zhì)醇本身具有紫外吸收,血液樣品可以色譜分離后直接用紫外檢測器檢測,但是唾液樣本中皮質(zhì)醇的含量比血液及尿液中的含量低約兩個數(shù)量級,通常人體唾液早晨的含量約為1.0-8.0 ng/mL,夜晚更低只有

8、0.1-1.0ng/mL左右,因此紫外檢測法不能滿足唾液中皮質(zhì)醇檢測的要求。本研究選用柱前衍生試劑——硫酸/乙醇溶液,先將皮質(zhì)醇衍生為具有較強(qiáng)熒光強(qiáng)度的衍生產(chǎn)物,然后通過測定皮質(zhì)醇衍生產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度對皮質(zhì)醇進(jìn)行定量分析。
　　 本文對于作者碩士期間建立的唾液皮質(zhì)醇高效液相色譜-熒光(HPLC-Flu)測定方法進(jìn)一步優(yōu)化操作程序(包括唾液黏性物去除,PFSPE提取、皮質(zhì)醇硫酸衍生,色譜分析內(nèi)標(biāo)物確定)。采用色譜柱為迪馬C18(4.

9、6×250mm,5um),硫酸/乙酸溶液為柱前衍生試劑,流速為1.0 mL/min,熒光檢測器檢測。皮質(zhì)醇在0.05～20 ng/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好(r=0.9997),本方法簡便、快速、準(zhǔn)確,可用于唾液中皮質(zhì)醇的測定。
　　 此外,本文優(yōu)化改進(jìn)了頭發(fā)樣本前處理操作,用柱前衍生化.高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)了人體頭發(fā)中皮質(zhì)醇和動物毛發(fā)中皮質(zhì)酮的高靈敏檢測。
　　 三、唾液α-淀粉酶流動注射分析方法建立
　　 本文建

10、立了一種快速、簡便的基于流動注射光度法測定唾液α-淀粉酶的方法。該方法測定一個樣本的周期僅為58s,可以實(shí)現(xiàn)自動化操作,精密度高,避免人工操作上時間控制不當(dāng)所導(dǎo)致的測定差異大的缺點(diǎn)。用所建的方法測定運(yùn)動應(yīng)激實(shí)驗(yàn)前后的唾液樣本,能較好的監(jiān)測到應(yīng)激過程,且方法重現(xiàn)性較好。
　　 四、尿液兒茶酚胺PFSPE提取HPLC-ECD檢測方法研究
　　 本文采用靜電紡絲技術(shù)制備聚冠醚-聚苯乙烯(PCE-PS)復(fù)合納米纖維,相比文獻(xiàn)用化

11、學(xué)合成的方法制備冠醚聚苯乙烯樹脂不僅操作簡單方便、化學(xué)試劑用量少,而且用于SPE的填料使用量也大大減少,本方法只需2mg左右的纖維,而文獻(xiàn)方法需要70rag左右的改性樹脂。所以本實(shí)驗(yàn)所需要的相應(yīng)活化、洗脫溶劑量也可以大大的減少。此外,本實(shí)驗(yàn)不需要氮?dú)獯蹈删涂梢赃_(dá)到濃縮樣品的目的,而文獻(xiàn)中由于洗脫溶劑要1mL,如果不吹干復(fù)溶,就無法達(dá)到濃縮富集目標(biāo)物的目的。本文通過實(shí)驗(yàn)對比、圖譜表征,并廣泛查詢文獻(xiàn),探討了PCE-PS復(fù)合納米纖維對兒茶酚

12、胺類化合物的吸附機(jī)理。此外,采用PCE-PS復(fù)合納米纖維裝填的PFSPE柱處理尿液,不僅對目標(biāo)物提取效果良好,而且能夠去除尿液中的大多數(shù)干擾物質(zhì),實(shí)現(xiàn)了尿液中幾種兒茶酚胺物質(zhì)的選擇性提取。
　　 五、人體應(yīng)激實(shí)驗(yàn)生物樣本測定,唾液中皮質(zhì)醇和唾液α-淀粉酶兩種應(yīng)激生物標(biāo)志物比較研究
　　 本文主要采用三個條件的應(yīng)激實(shí)驗(yàn),包括公開演講實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動應(yīng)激實(shí)驗(yàn)和考試焦慮被試對注意偏向抑制實(shí)驗(yàn),取被試自然流出的混合唾液作為測試樣本,進(jìn)