應激標志物快速檢測技術用于人體應激反應實驗研究.pdf

1、現代應激概念認為:應激是一種當機體內環(huán)境穩(wěn)定受到威脅時,機體對應激源產生特異性和(或)非特異性反應。應激的啟動以一系列的反應體現出來,這些反應包括分子水平上的生物化學反應,激素水平層面上的調控以及系統(tǒng)整合方面的行為、情緒和認知的變化等等,統(tǒng)稱為應激反應。應激作為發(fā)病機制已經涉及臨床各科,特別是心血管疾病、神經精神病、胃腸疾病和內分泌疾病等高發(fā)病率的疾病與應激密切相關,也對人的學習和認知過程產生影響。因此眾多研究者一直想把應激狀態(tài)客觀地測

2、量出來,以便定量地觀察應激過程。由于至今沒有一種方法能全面、準確地對應激狀態(tài)進行評估。因此,進一步探討應激反應規(guī)律,不斷改進和完善應激評估指標,對準確測量應激反應、預防應激對機體造成的損害有重要意義。目前用于應激研究的生化物質主要有兒茶酚胺類、糖皮質激素(主要是皮質醇)、唾液α-淀粉酶。檢測的生物樣本包括組織、腦脊液、血液、尿液、唾液等,對于人體研究,研究報道最多的是血液,然而抽血本身是一種急性應激源,亦可能造成人體應激反應,導致生化指

3、標瞬時變化。近年來唾液樣品的測定在精神神經內分泌研究中顯得日益重要,唾液.采集無創(chuàng)傷、簡便、易被接受,尤其適合幼兒研究。此外,研究證實頭發(fā)皮質醇是一種研究長期HPA軸活性很好的工具,可以客觀測量慢性應激,所以頭發(fā)樣本分析也必將成為生理學、精神醫(yī)學、體育醫(yī)學、認知科學、心理學等眾多領域的研究手段之一。
　　 本文開展了以下五個主要內容的研究工作:(1)唾液中皮質醇的高效液相色譜.熒光檢測方法;(2)頭發(fā)中皮質醇高效液相色譜.熒光檢

4、測方法:(3)唾液α-淀粉酶含量的流動注射分析方法;(4)尿液中兒茶酚胺選擇性提取高效液相色譜—電化學檢測方法:(5)人體應激實驗生物樣本測定,唾液皮質醇和唾液α-淀粉酶兩種應激生物標志物比較研究。
　　 本課題的研究將為為生理學、精神醫(yī)學、體育醫(yī)學、認知科學、心理學研究提供知識和技術支持。
　　 論文主要工作如下:
　　 一、生物樣本中目標物前處理方法的研究
　　 采用本實驗室研制的幾種納米纖維作為固相

5、萃取柱的吸附劑,填裝固相微萃取小柱開展了基于納米纖維的固相萃取(Packed-fiber solid-phase extraction,PFSPE)樣品前處理研究,內容包括生物樣品中目標物的提取和雜質凈化去除兩方面的研究:
　　 (1)以聚苯乙烯電紡納米纖維為萃取介質,分離提取唾液和頭發(fā)浸出液中皮質醇,提取回收效率近100％,操作快速、高效。此外,用PFSPE法提取皮質醇強酸衍生物,效率遠高于文獻報道的溶劑提取法,很好的解決了衍

6、生物需要快速與反應介質分離,確保衍生物穩(wěn)定性的難題,并且克服了文獻報道方法提取回收率低、凈化效果差的缺點,不僅使得檢測靈敏度提高、干擾減少,而且提取過程簡便、快速、環(huán)保。
　　 (2)采用合成的聚冠醚與聚苯乙烯高分子混合電紡,制備出一種新型的納米纖維材料,用此材料為萃取介質裝填固相萃取小柱,對兒茶酚胺類物質進行提取分析研究,構建了尿液生物樣品中兒茶酚胺類物質高效分離、凈化、富集于一體的快速樣品前處理方法。
　　 (3)比

7、較了不同成分納米纖維和脫脂棉去除唾液中粘性物質的效率,掌握了用PFSPE方法去除大分子粘性物質的方法,為實現唾液樣品自動化前處理研究奠定了基礎。
　　 二、優(yōu)化柱前衍生化—高效液相色譜法,建立唾液和頭發(fā)中皮質醇的測定方法
　　 皮質醇本身具有紫外吸收,血液樣品可以色譜分離后直接用紫外檢測器檢測,但是唾液樣本中皮質醇的含量比血液及尿液中的含量低約兩個數量級,通常人體唾液早晨的含量約為1.0-8.0 ng/mL,夜晚更低只有

8、0.1-1.0ng/mL左右,因此紫外檢測法不能滿足唾液中皮質醇檢測的要求。本研究選用柱前衍生試劑——硫酸/乙醇溶液,先將皮質醇衍生為具有較強熒光強度的衍生產物,然后通過測定皮質醇衍生產物的熒光強度對皮質醇進行定量分析。
　　 本文對于作者碩士期間建立的唾液皮質醇高效液相色譜-熒光(HPLC-Flu)測定方法進一步優(yōu)化操作程序(包括唾液黏性物去除,PFSPE提取、皮質醇硫酸衍生,色譜分析內標物確定)。采用色譜柱為迪馬C18(4.

9、6×250mm,5um),硫酸/乙酸溶液為柱前衍生試劑,流速為1.0 mL/min,熒光檢測器檢測。皮質醇在0.05～20 ng/mL范圍內,線性關系良好(r=0.9997),本方法簡便、快速、準確,可用于唾液中皮質醇的測定。
　　 此外,本文優(yōu)化改進了頭發(fā)樣本前處理操作,用柱前衍生化.高效液相色譜法實現了人體頭發(fā)中皮質醇和動物毛發(fā)中皮質酮的高靈敏檢測。
　　 三、唾液α-淀粉酶流動注射分析方法建立
　　 本文建

10、立了一種快速、簡便的基于流動注射光度法測定唾液α-淀粉酶的方法。該方法測定一個樣本的周期僅為58s,可以實現自動化操作,精密度高,避免人工操作上時間控制不當所導致的測定差異大的缺點。用所建的方法測定運動應激實驗前后的唾液樣本,能較好的監(jiān)測到應激過程,且方法重現性較好。
　　 四、尿液兒茶酚胺PFSPE提取HPLC-ECD檢測方法研究
　　 本文采用靜電紡絲技術制備聚冠醚-聚苯乙烯(PCE-PS)復合納米纖維,相比文獻用化

11、學合成的方法制備冠醚聚苯乙烯樹脂不僅操作簡單方便、化學試劑用量少,而且用于SPE的填料使用量也大大減少,本方法只需2mg左右的纖維,而文獻方法需要70rag左右的改性樹脂。所以本實驗所需要的相應活化、洗脫溶劑量也可以大大的減少。此外,本實驗不需要氮氣吹干就可以達到濃縮樣品的目的,而文獻中由于洗脫溶劑要1mL,如果不吹干復溶,就無法達到濃縮富集目標物的目的。本文通過實驗對比、圖譜表征,并廣泛查詢文獻,探討了PCE-PS復合納米纖維對兒茶酚

12、胺類化合物的吸附機理。此外,采用PCE-PS復合納米纖維裝填的PFSPE柱處理尿液,不僅對目標物提取效果良好,而且能夠去除尿液中的大多數干擾物質,實現了尿液中幾種兒茶酚胺物質的選擇性提取。
　　 五、人體應激實驗生物樣本測定,唾液中皮質醇和唾液α-淀粉酶兩種應激生物標志物比較研究
　　 本文主要采用三個條件的應激實驗,包括公開演講實驗、運動應激實驗和考試焦慮被試對注意偏向抑制實驗,取被試自然流出的混合唾液作為測試樣本,進