抗人D-二聚體單克隆抗體的制備及應(yīng)用初探.pdf

1、目的:從人交聯(lián)纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)中純化D-二聚體(D-dimer)，并以人D-二聚體為抗原制該蛋白質(zhì)的單克隆抗體(McAb)，在對(duì)其相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上，初步探索抗D-二聚體單克隆抗體(D-dimer McAb)的應(yīng)用。
　　方法:1.利用人纖維蛋白原、凝血酶、凝血因子ⅩⅢ、纖溶酶制備人交聯(lián)纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP);
　　2.采用Sephacryl S-300層析過濾和PBE94聚焦層析兩步法從FDP中分離純化

2、D-dimer;
　　3.用純化的D-dimer免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)建立可分泌D-dimer McAb的雜交瘤細(xì)胞株，并對(duì)其進(jìn)行核染色體分析，同時(shí)使用間接ELISA法檢測雜交瘤細(xì)胞株持續(xù)穩(wěn)定分泌抗體的能力。選取8株細(xì)胞株，采用體內(nèi)誘生腹水法制備腹水，并用半飽和硫酸銨沉淀法和DEAEaffi-gel blue層析法分離純化腹水中的D-dimer McAb;
　　4.采用SDS-PAGE電泳鑒定抗體的純度;瓊脂糖

3、免疫雙向擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)鑒定D-dimer McAb的亞類;ELISA相加實(shí)驗(yàn)確定D-dimer McAb識(shí)別的抗原表位;間接ELISA法檢測D-dimer McAb的特異性，包括檢測其是否與D-片段、E-片段、纖維蛋白原、凝血酶和FⅩⅢ有交叉反應(yīng)和與D-dimer標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)情況;間接ELISA檢測D-dimer McAb的相對(duì)親和力及五種二價(jià)金屬離子對(duì)抗原抗體結(jié)合的影響。
　　5.分別將03、05、07號(hào)D-dimer McAb與表面

4、包被羧基基團(tuán)的聚苯乙烯乳膠微粒進(jìn)行偶聯(lián)，檢測其偶聯(lián)效果。并將偶聯(lián)好的微粒與D-dimer混合，進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，檢測其反應(yīng)效果。
　　結(jié)果:1.經(jīng)兩步層析純化，D-dimer的回收率為(27.27±6.35)％，D-dimer/總蛋白含量比為(77.82±7.98)％(n=3)。
　　2.成功建立了8株能分泌D-dimer McAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別編號(hào)為01～08，其核染色體平均數(shù)為86～93。建立的8株雜交瘤細(xì)胞株

5、已連續(xù)5個(gè)月穩(wěn)定分泌抗體。
　　3.8株D-dimer McAb的性質(zhì)鑒定結(jié)果如下:
　　所有抗體的亞型都是IgG2b;除02、08號(hào)D-dimer McAb外，01、03、04、05、06、07號(hào)D-dimer McAb與D-dimer標(biāo)準(zhǔn)品都有較高的反應(yīng)性;8株D-dimer McAb與D-片段、E-片段，纖維蛋白原、凝血酶和FⅩⅢ無交叉反應(yīng);8株D-dimer McAb分別識(shí)別同一抗原表位或者識(shí)別的抗原表位在空間上較為

6、接近;8株D-dimer McAb與抗原的相對(duì)親和力順序?yàn)?3＞07≥05＞04≥01≥02≥06＞08; Zn2+能有效抑制01～08號(hào)D-dimer McAb與抗原的結(jié)合，Mn2+對(duì)06、07號(hào)D-dimer McAb與抗原的結(jié)合有抑制作用，但抑制效果較Zn2+弱。
　　4.D-dimer McAb偶聯(lián)聚苯乙烯乳膠微粒的效果較好，但各株細(xì)胞的固定化率和特異性不一，03號(hào)抗體的偶聯(lián)率為52.16％、05號(hào)為29.80％、07號(hào)為

7、77.41％。偶聯(lián)上抗體的聚苯乙烯乳膠微粒與D-dimer結(jié)合后，離心上清液在280nm處的吸光度平均下降59.54％。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的兩步層析法能有效地分離純化D-dimer，且純化的D-dimer能誘使BALB/c小鼠產(chǎn)生較高的免疫反應(yīng);成功建立了8株能分泌D-dimer McAb的雜交瘤細(xì)胞株;利用D-dimer McAb偶聯(lián)聚苯乙烯乳膠微粒，偶聯(lián)的微?？梢院虳-dimer結(jié)合，為后續(xù)D-dimer檢測試劑盒的開發(fā)