Rap1GAP抑制黑色素瘤VEGF自分泌和旁分泌機(jī)制研究.pdf

1、目的：構(gòu)建高表達(dá)Rap1GAP的黑色素瘤細(xì)胞系，研究Rap1GAP的高表達(dá)對(duì)黑色素瘤成瘤的影響及其機(jī)制。探討高表達(dá)Rap1GAP的黑色素瘤細(xì)胞中，Rap1GAP 對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的合成、分泌VEGF，以及抑制VEGF 作用的機(jī)制，并研究VEGF 對(duì)黑色素瘤細(xì)胞行為學(xué)的影響。探討高表達(dá)Rap1GAP的黑色素瘤細(xì)胞旁分泌VEGF的功能的作用，以及其對(duì)黑色素瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　　 方法：以pcDNA-Rap1GAP-Flagge

2、d 質(zhì)粒和pcDNA3.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞，將上述細(xì)胞皮下注射于裸鼠建立腫瘤模型；比較不同Rap1GAP表達(dá)水平細(xì)胞成瘤生長的差異；通過免疫組化染色比較不同Rap1GAP表達(dá)水平下，新生血管的數(shù)量；應(yīng)用Epac、PD98059以及LY294002等工具藥物激活或抑制Rap1 及其下游信號(hào)分子，用免疫印跡方法測定相關(guān)蛋白表達(dá)水平；并在不同條件下，用MTT 方法比較VEGF對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生長和增殖的作用及機(jī)制；用Transwell和酶

3、譜分析檢測其遷移能力的改變，TUNEL 染色檢測細(xì)胞凋亡等生物行為學(xué)改變。收集不同Rap1GAP水平的黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清，用ELISA 方法檢測培養(yǎng)基上清中的VEGF 含量；用此培養(yǎng)基上清交叉培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，比較不同Rap1GAP水平的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)其反應(yīng)的差異；并研究黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中Rap1GTP水平的影響。并用Western Blot檢測血管形成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平差異。
　　 結(jié)果：高表達(dá)Rap1GAP的黑色

4、素瘤細(xì)胞在成瘤瘤體體積，新生血管數(shù)量上較正常表達(dá)Rap1GAP的細(xì)胞顯著下降；進(jìn)一步研究表明，在高表達(dá)Rap1GAP的黑色素瘤中，HIF-a和VEGF表達(dá)顯著下降。細(xì)胞免疫印跡結(jié)果與組織檢測結(jié)果相同，體外實(shí)驗(yàn)同樣表明，Rap1GAP 可以抑制Rap1GTP的水平，同時(shí)降低HIF-a和VEGF的表達(dá)。Epac在體外實(shí)驗(yàn)中可以促進(jìn)VEGF和p-ERK表達(dá)，但是這一效果可以被Rap1GAP和PD98059 取消；VEGF在體外試驗(yàn)中可以增加R

5、ap1 活性，從而活化ERK和Akt通路，但這種作用同樣為Rap1GAP 抑制；進(jìn)一步研究表明，VEGF 可以抑制黑色素瘤中的凋亡蛋白，如Caspase 3、Caspase 9的表達(dá)，并通過增加Cyclin D1等蛋白的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)提高M(jìn)MP-9、MMP-2活性；細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，上述作用在高表達(dá)Rap1GAP的黑色素瘤細(xì)胞中均被抑制。ELISA 結(jié)果顯示，高表達(dá)Rap1GAP的黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清中

6、，VEGF的含量較pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯著下降；而用黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清交叉培養(yǎng)后，Rap1GTP的水平較普通培養(yǎng)基培養(yǎng)下顯著升高；同時(shí)，此升高作用可以被VEGF的抑制劑取消。
　　 結(jié)論：Rap1GAP 對(duì)黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展具有一定的抑制作用，其作用機(jī)制可能通過抑制VEGF和HIF-a表達(dá)。VEGF在黑色素瘤的生長過程中具有自分泌作用，其作用機(jī)制通過Akt和ERK 途徑實(shí)現(xiàn)；同時(shí)VEGF 不斷刺激黑色素瘤分泌而形成正反

7、饋機(jī)制，從而使得細(xì)胞的增殖失控，最終導(dǎo)致腫瘤形成；ERK 磷酸化后可以抑制VEGF的mRNA 降解，從而在翻譯水平上增加VEGF表達(dá)；Akt 通路活化在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有核心作用，并通過增加HIF-a表達(dá)而增加VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；Rap1GAP 可以抑制上述增加VEGF表達(dá)的翻譯和轉(zhuǎn)錄作用；同時(shí)，Rap1GAP可以抑制VEGF 刺激細(xì)胞引起的下游效應(yīng)蛋白表達(dá)增加，而抑制VEGF的生物學(xué)效應(yīng)。
　　 此外，黑色