自由基清除劑依達(dá)拉奉對(duì)脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠痛行為的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、[目的]神經(jīng)病理性疼痛是由神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)疾病或其它疾患所導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙既而引起的疼痛。然而由于神經(jīng)源性疼痛的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,到目前為止,臨床上仍缺乏滿(mǎn)意地鎮(zhèn)痛藥物。對(duì)于慢性神經(jīng)病理性疼痛的治療,目前除了非甾體抗炎藥和阿片制劑以外,并沒(méi)有很多的選擇,其治療的滿(mǎn)意率小于≤30％。某些慢性病患者很容易對(duì)嗎啡形成依賴(lài),甚至成癮,而非甾體抗炎藥又有很多的不良反應(yīng),因此需要介于這兩者之間的藥物。新近的研究發(fā)現(xiàn)活性氧參與了神經(jīng)痛和炎性痛的

2、發(fā)生和發(fā)展。依達(dá)拉奉是日本新開(kāi)發(fā)的一種針對(duì)腦梗死急新型自由基清除劑,有學(xué)者將其用于炎癥痛的實(shí)驗(yàn)研究,發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉具有鎮(zhèn)痛作用,但是到目前為止,還未見(jiàn)其用于治療神經(jīng)病理性疼痛的研究。本實(shí)驗(yàn)采用脊神經(jīng)結(jié)扎模型誘發(fā)經(jīng)典的神經(jīng)病理性疼痛模型,觀察自由基清除劑依達(dá)拉奉是否具有鎮(zhèn)痛作用,如果證實(shí)其有鎮(zhèn)痛作用后,則進(jìn)行初步的機(jī)制探討。 [方法]行為學(xué)實(shí)驗(yàn)采用脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)神經(jīng)病理性疼痛模型,以機(jī)械刺激(Von Frey hair)為研究

3、方法,分別觀察依達(dá)拉奉預(yù)給藥和治療干預(yù)對(duì)神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛閾的影響。在觀察依達(dá)拉奉治療干預(yù)效果時(shí),在脊神經(jīng)結(jié)扎后第三天神經(jīng)痛發(fā)生以后,分別給予疼痛大鼠2、4、8 mg/kg依達(dá)拉奉(2/d)和生理鹽水對(duì)照組,觀察依達(dá)拉奉的鎮(zhèn)痛效果；觀測(cè)依達(dá)拉奉預(yù)干預(yù)效果時(shí),在手術(shù)前-天給予依達(dá)拉奉,然后持續(xù)2天給藥,分組及行為學(xué)檢測(cè)同治療干預(yù)。電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)采用H2O2誘發(fā)的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)氧化損傷模型作為研究工具。急性分離培養(yǎng)正常大鼠雙側(cè)腰5 DRG

4、,選中對(duì)辣椒素有反應(yīng)的小細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察依達(dá)拉奉預(yù)給藥和治療干預(yù)對(duì)200μmol/L H2O2誘發(fā)氧化損傷的細(xì)胞膜電位的影響。 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究分為假手術(shù)組、SNL組、依達(dá)拉奉干預(yù)組,以免疫組織化學(xué)和western blot技術(shù)為方法,觀察脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)痛模型中pJNK在DRG和脊髓中的表達(dá)分布及觀察依達(dá)拉奉對(duì)pJNK的表達(dá)的影響。 [結(jié)果] 行為學(xué)實(shí)驗(yàn): (1)依達(dá)拉奉治療干預(yù)實(shí)驗(yàn):①脊神經(jīng)結(jié)扎后

5、第三天大鼠痛閾達(dá)到最低,機(jī)械閾值(PWMT)為3.3±1.7g;痛敏持續(xù)到本實(shí)驗(yàn)結(jié)束,第10天PWMT為3.1±1.8g；②2 mg/kg和4 mg/kg依達(dá)拉奉干預(yù)組大鼠痛閾的改變和生理鹽水對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；③8mg/kg依達(dá)拉奉干預(yù)組產(chǎn)生微弱的鎮(zhèn)痛作用,鎮(zhèn)痛效果持續(xù)2天,在停止給藥3天后,大鼠痛行為和對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。 (2)依達(dá)拉奉預(yù)處理實(shí)驗(yàn) 4mg/kg依達(dá)拉奉預(yù)處理組術(shù)后5天PWMT和對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異干預(yù)組大

6、鼠痛閾的改變和生理鹽水對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在術(shù)后第六天,依達(dá)拉奉預(yù)處理組PWMT和生理鹽水對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯。 電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)： (1)在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷模型中,神經(jīng)元電壓閾值發(fā)生較持久的改變,膜電位由-58.13±2.41mv增高到-42.32±3.08mv,兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而后用依達(dá)拉奉干預(yù)后,并沒(méi)有改變H2O2誘發(fā)的神經(jīng)元電壓閾值； (2)首先給予依達(dá)拉奉預(yù)處理神經(jīng)元,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元膜電位開(kāi)始

7、降低,發(fā)生超極化現(xiàn)象,當(dāng)膜電位不再發(fā)生變化時(shí),細(xì)胞外液給予400μM H2O2,依達(dá)拉奉可以明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的去極化。 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)： (1)依達(dá)拉奉減少L5DRG中pJNK陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)。假手術(shù)組、SNL組與依達(dá)拉奉預(yù)處理組大鼠分別于脊神經(jīng)結(jié)扎后24小時(shí)取材,觀察切片發(fā)現(xiàn)pJNK主要表達(dá)在小細(xì)胞神經(jīng)元,模型組pJNK陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯高于對(duì)照組,兩者存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；依達(dá)拉奉干預(yù)組pJNK陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量為9

8、3±8,和SNL組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量124±5也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Western blot定量顯示JNK1(46 kDa)在SNL組DRG存在高表達(dá),依達(dá)拉奉可以降低神經(jīng)痛背根神經(jīng)節(jié)中pJNK的含量。 (2)依達(dá)拉奉減少脊髓星型膠質(zhì)細(xì)胞pJNK的表達(dá)。假手術(shù)組、SNL組與依達(dá)拉奉預(yù)處理組大鼠分別于脊神經(jīng)結(jié)扎3d后取材,觀察切片。免疫雙熒光顯示pJNK在脊髓中只在星型膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),并且在脊神經(jīng)損傷后,GFAP/pJNK陽(yáng)性細(xì)胞在損傷側(cè)