鴨疫里默氏桿菌OEP基因表達、不同濃度四環(huán)素條件下OEP表達量的差異.pdf

1、本論文對鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)外膜外排基因做了以下的一些研究:RA(outer membrane effiux protein，OEP)外膜外排蛋白基因核苷酸生物學(xué)特性分析、該基因編碼的蛋白生物學(xué)特性分析、外膜外排基因的T克隆及亞克隆、原核表達、重組蛋白的純化、兔抗RA外膜外排基因多克隆抗體的制備、多克隆抗體的粗提、用實時熒光定量PCR的方法來檢測RA外膜外排蛋白基因表達量與RA耐四環(huán)素

2、的關(guān)系。結(jié)果如下:
　　1.RA外膜外排蛋白基因生物信息學(xué)分析
　　該基因有一個完整的ORF，其基因片段長度為1437bp，NCBI BLASTN進行序列比對發(fā)現(xiàn)該基因與GenBank上提交的RA CH-2和RA ATCC11845的外膜外排蛋白基因序列相似度最高，對RA OEP基因密碼子偏嗜性分析顯示該基因密碼子的偏性比較弱并且沒有2個以上的稀有密碼子串。系統(tǒng)進化樹分析該蛋白質(zhì)與RA CH-2和RAATCC11845外膜外

3、排蛋白的親緣關(guān)系最近，并且還屬于同一分支，有信號肽，但沒跨膜區(qū)，抗原表位相對集中，有4種不同的功能位點，即分別為蛋白激酶C磷酸化位點、N-豆蔻?；稽c、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點及N-糖基化位點。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示α螺旋占主要部分，該基因編碼蛋白定位在外膜上。
　　2.RA外膜外排蛋白基因T克隆、原核表達及多克隆抗體制備
　　依據(jù)外膜外排蛋白基因序列設(shè)計一對合適的引物，用于PCR的擴增，其擴增出的基因片段長度為1437bp。構(gòu)建重

4、組原核表達質(zhì)粒pET-32a(+)/OEP，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，用IPTG使其誘導(dǎo)表達，表達出一個約為64KD的融合蛋白。純化重組蛋白，并對新西蘭大白兔進行免疫，制備出多克隆抗體，即兔抗RA OEP血清，制備的血清瓊擴效價為1∶16，Western-Blot顯示兔抗RA血清能與純化的重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　3.RA外膜外排蛋白基因表達量與不同濃度四環(huán)素的關(guān)系
　　RA耐四環(huán)素MIC值的測定采用的是二倍稀釋法