水稻Rho GTP酶激活蛋白基因OsRhoGAP2及其啟動(dòng)子在分子育種上的應(yīng)用潛力評(píng)估.pdf

1、水稻不僅是主要的糧食作物，同時(shí)也是重要的模式植物，對(duì)水稻相關(guān)農(nóng)藝性狀功能基因的鑒定意義重大。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)水稻育性控制相關(guān)信號(hào)通路開展研究，通過(guò)酵母雙雜交篩選，從水稻雌雄蕊形成期幼穗cDNA文庫(kù)中分離到若干與Rho蛋白OsRacD相互作用蛋白的編碼基因，其中包括一種Rho GTP酶激活蛋白基因，命名為OsRhoGAP2（GenBank登錄號(hào):AY364311）。本研究對(duì)該基因及其啟動(dòng)子開展系統(tǒng)的功能鑒定和元件分析，以此評(píng)估該基因在分子設(shè)

2、計(jì)育種上的應(yīng)用潛力。
　　基于本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的該基因啟動(dòng)子及5個(gè)5'端缺失片段載體，分別轉(zhuǎn)化篩選擬南芥，每個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥均獲得3個(gè)以上的純合株系。通過(guò)GUS組織化學(xué)染色、酶活力測(cè)定結(jié)合缺失實(shí)驗(yàn)分析，研究不同啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在生長(zhǎng)發(fā)育不同階段、不同組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在OsRhoGAP2啟動(dòng)子5'端的-703bp～-289bp區(qū)域內(nèi)可能著存在1個(gè)重要的花藥特異性元件，驅(qū)動(dòng)了GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥的花藥中表達(dá)，尤其是在小

3、孢子發(fā)育的初期，而在成熟期時(shí)，擬南芥的營(yíng)養(yǎng)器官（根、莖、葉）以及繁殖器官（果莢）中均沒(méi)有表達(dá)，由此推測(cè)，OsRhoGAP2基因可能在小孢予發(fā)育初期表達(dá)，對(duì)維持花藥正常發(fā)育有重要作用。通過(guò)5種激素(IAA、6-BA、GA、SA、MeJA)、5種脅迫處理（高溫、低溫、干旱、高鹽、黑暗）對(duì)生長(zhǎng)到10d的轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行噴施處理，結(jié)合GUS染色，研究不同啟動(dòng)子片段對(duì)激素、非生物脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子可能是1個(gè)與IAA誘導(dǎo)相關(guān)及脅迫誘導(dǎo)相關(guān)

4、的啟動(dòng)子，在IAA及高溫、干旱、高鹽誘導(dǎo)條件下能驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá)，而對(duì)其他激素沒(méi)有響應(yīng)。進(jìn)一步推測(cè)，OsRhoGAP2基因可能參與到了IAA誘導(dǎo)相關(guān)及逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的應(yīng)答過(guò)程。結(jié)合5'端的缺失實(shí)驗(yàn)表明，在該基因啟動(dòng)子的-1292 bp～-948 bp存在1個(gè)重要的MeJA響應(yīng)元件，推測(cè)該基因可能參與了MeJA信號(hào)通路。
　　基于本實(shí)驗(yàn)室前期工作，本研究對(duì)OsRhoGAP2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻T2代進(jìn)行了分子檢測(cè)和表型分析，旨在了解該

5、基因在生產(chǎn)上的應(yīng)用潛力。通過(guò)提取轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA結(jié)合PCR擴(kuò)增，對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)90％以上都是陽(yáng)性植株;通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在T2代轉(zhuǎn)基因水稻中，OsRhoGAP2基因表達(dá)量均在14倍以上，其中最高的達(dá)到了229倍;對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因水稻農(nóng)藝學(xué)性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，其有效分蘗數(shù)有了顯著提高，提高了32.35％-38.75％。提示在分子設(shè)計(jì)育種中，可以通過(guò)提高OsRhoGAP2基因的表達(dá)水