順鉑激活CNE-2Z細(xì)胞氯通道的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的探討.pdf

1、【目的】1)研究順鉑激活的氯通道的電流特性；2)探討順鉑激活的氯通道與容積敏感性氯通道之間的關(guān)系；3)研究Ca<'2+>及嘌呤受體在順鉑激活氯通道的過程中所起的作用，探討順鉑激活氯通道的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 【方法】1)膜片鉗技術(shù)記錄順鉑激活的低分化鼻咽癌細(xì)胞(CNE-2Z細(xì)胞)全細(xì)胞電流，計算電流密度；2)去除細(xì)胞內(nèi)液的ATP，觀察順鉑激活的氯電流對胞內(nèi)ATP的依賴性；3)離子置換法分析通道對離子的選擇性；4)觀察氯通道阻斷劑對順鉑

2、激活的氯電流的影響，計算其抑制率；5)改變細(xì)胞外滲透壓，觀察順鉑激活的氯電流的電流密度大小的改變；6)去除細(xì)胞外或/和細(xì)胞內(nèi)的Ca<'2+>以及加入鈣通道阻斷劑，觀察順鉑激活的氯電流對Ca<'2+>的依賴性；7)觀察嘌呤受體阻斷劑及ATP酶對順鉑激活的氯電流的影響，計算其抑制率。 【結(jié)果】 1)用5μmol/L順鉑灌流細(xì)胞，在(215.95±29.34)s時激活一電流，該電流逐漸增大，約(744.27±67.75)s達(dá)到

3、最大值，細(xì)胞平均電流為(-56.48±3.43)pA/pF(-80mV)和(79.48 ±4.51)pA/pF(+80mV)(n=28，P<0.01)；其外向電流較之內(nèi)向電流大，表現(xiàn)為明顯外向優(yōu)勢，該電流的翻轉(zhuǎn)電位是(-6.69±1.54)mV，與氯離子平衡電位理論計算值(-0.9mV)接近；I<'->，Br，Gluconate在CNE-2Z細(xì)胞的通透性為(與C1．相比較，設(shè)定Cl<'->為1)：r<'->為1.06±0.036(n=4

4、，t=0.81；P>0.05)，Br<'->為1.05±0.034(n=3，t=0.35；P>0.05)，gluconate為0.28±0.057(n=5，f=-8.19；P<0.01)；此外，該電流表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)ATP依賴性(n=4)。 2)胞外10mmol/LATP能顯著抑制順鉑激活的氯電流。在+80mV時對外向電流的抑制率達(dá)到(73.77 ±6.55)％(t=3.20,P<0.01)，在-80mV時為(61.90 ±6.37

5、)％(f=-2.81,P<0.05)(n=6)。另一種氯通道阻斷劑tamoxifen亦能抑制此電流。30μmol/Ltamoxifen完全阻抑外向t=-16.68；P<0.01)和內(nèi)向電流(t=-54.64；P<0.01)(n=3)。 3)低滲可使順鉑激活的氯電流增大，在鉗制電壓為-80mV時，電流從(-32.98±5.44)pA/pF增大到(-57.86±11.65)pA/pF(n=6，t=2.75；P<0.05)，而在+80

6、mV時，電流從(42.58±8.20)pA/pF，增大到(75.034±12.59)pA/pF(n=6，t=-4．48；P<0.01)；此外，順鉑激活的氯電流對高滲刺激敏感，47％高滲灌流液在+80mV時對外向電流的抑制率達(dá)到(91.27±4.20)％q=5.41；P<0.01)，在-80mV時為(91.77±3.59)％（t=-5.10；P<0.01)(n=6)。 4)順鉑在細(xì)胞外無Ca<'2+>、細(xì)胞內(nèi)無Ca<'2+>、細(xì)胞

7、內(nèi)外均無Ca<'2+>的情況下均能激活氯電流。細(xì)胞外無Ca<'2+>時其電流密度比對照組小(n=9，+80mV時，t=4.00，P<0.01；在-80mV時，t=2.65，P<0.05)，潛伏期比對照組長t=-2.89，P<0.01)；達(dá)峰時間也增加(t=-2.52，P<0.05)。鈣通道阻斷劑nifedipine并不能抑制順鉑激活的氯電流(n=7)。 5)嘌呤受體阻斷劑suramin能顯著抑制順鉑激活的氯電流，其抑制效應(yīng)呈劑量

8、依賴性，100μmol/Lsuramin對外向和內(nèi)向電流的抑制率分別為(93.114±3.39)％和(62.71±3.02)％，其對外向電流和內(nèi)向電流的抑制作用有差異(n=5，f=-6.69，P<0.01)。對P2Y亞型具有更大選擇性的嘌呤受體拮抗劑RB2(反應(yīng)藍(lán)2)亦能明顯抑制此電流，其抑制效應(yīng)在1～lOOpmol/L濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性，100μmol/L RB2在+80mV時對外向電流的抑制率達(dá)到(71.32±2.57)％(t=

9、10.64，P<0.01)，在-80mV時為(65.45±2.71)％(f=-9.33，P<0.01)(n=5)。100μmol/L RB2達(dá)最大效應(yīng)濃度，增大濃度至200/tmol/L甚至400μmol/L，其抑制率不再增大。 6)ATP酶(apyrase)能阻抑順鉑激活的氯電流，20units/ml apyrase分別阻斷外向電流(52.04 ±4.64)％(t=3.38，P<0.05)和內(nèi)向電流(50.52 ±9.39)％

10、(t=-2.69，P>0.05)(n=3)，其對外向電流和內(nèi)向電流的抑制作用差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.14，P>0.05)。用apyrase預(yù)處理CNE-2Z細(xì)胞后，順鉑激活的電流密度比對照組小，洗脫apyrase后，電流增大。 【結(jié)論】 1)順鉑激活的CNE-2Z細(xì)胞氯電流的電流特性與藥理學(xué)特性均與低滲激活的容積敏感性氯電流相似，提示了順鉑激活的CNE-2Z細(xì)胞氯通道很可能就是容積敏感性氯通道。 2)當(dāng)細(xì)