胰腺癌及其播散途徑中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分布和調(diào)控機(jī)理研究.pdf

1、胰腺腺癌是具有高度侵犯性及危害性的惡性腫瘤，起病隱匿且極易轉(zhuǎn)移，缺乏有效的早期診斷方法，現(xiàn)有的手術(shù)及放化療等抗腫瘤治療療效均欠理想，1年及5年生存率僅分別為23％及5％。研究胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，可能發(fā)掘預(yù)測胰腺癌預(yù)后、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的新指標(biāo)及抗腫瘤治療的靶點，具有重大的臨床價值及社會效益。
　　調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，T reg)，具有抑制抗腫瘤免疫，促進(jìn)腫瘤逃逸免疫監(jiān)視的作用。大量報道顯示具有CD4+CD

2、25+（相當(dāng)于CD4+CD25+FOXP3+或CD4+CD25+CD127Low/-）免疫表型的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在包括胰腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的腫瘤組織和外周血中的比例高于健康人。檢測Treg在腫瘤組織和播散途徑中的分布可能具有預(yù)測腫瘤預(yù)后、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的作用。抑制Treg生長及遷徙可能成為抗腫瘤治療的新策略，Treg亦有可能成為評價抗腫瘤治療效果的指標(biāo)之一。
　　已知CD4+CD25+T reg的分布水平受某些細(xì)胞因子調(diào)控，其中細(xì)胞因

3、子CCL22對CD4+CD25+T reg有趨化作用，因CD4+CD25+T reg所表達(dá)的CCR4是CCL22的受體。多種胰腺癌細(xì)胞株可分泌CCL22，但人胰腺癌組織中的CCL22表達(dá)情況至今尚不明確。
　　CCL22表達(dá)受多步驟調(diào)節(jié)，在轉(zhuǎn)錄水平上CCL22可接受NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。課題小組前期研究及其他研究者均發(fā)現(xiàn)具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的原癌基因Pim-3在胰腺癌中高表達(dá)，而在非癌胰腺組織中不表達(dá)，提示Pim-3在

4、胰腺癌的發(fā)生過程中發(fā)揮作用。Pim-3與Pim-1和Pim-2屬于同一原癌基因家族，已知Pim-1能夠上調(diào)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。因此本課題擬研究與Pim-1具有高度同源性(71％)的Pim-3是否可能同樣通過激活NF-κB，促進(jìn)胰腺癌中CCL22的表達(dá)，進(jìn)一步明確Pim-3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，尤其是通過細(xì)胞因子信號途徑調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞分布的可能性，為胰腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后判斷及治療靶點的發(fā)掘提供新的思路。
　　第

5、一部分 調(diào)節(jié)T細(xì)胞在胰腺癌中的分布及腫瘤細(xì)胞Pim-3，CCL22的表達(dá)與胰腺癌預(yù)后的相關(guān)性研究。
　　目的：
　　探究原癌基因Pim-3及趨化因子CCL22的表達(dá)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之間相互作用關(guān)系，并探討三者作為胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移判斷指標(biāo)的可行性。
　　方法：
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreatic Ductal Adencarcinoma，PDAC)患者外周血、腫瘤引流通路上淋巴結(jié)(Tum

6、or draining lymph nodes，TDLN)中Treg的計數(shù)，免疫組化檢測腫瘤組織Pim-3及CCL22表達(dá)與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)中Treg計數(shù)。統(tǒng)計分析61例PDAC患者臨床病歷資料，探討Pim-3，CCL22表達(dá)，外周血，TDLN及TIL內(nèi)Treg計數(shù)與胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后間關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示:PDAC患者TDLN內(nèi)T

7、reg計數(shù)高于其外周血，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2、IHC檢測顯示:腫瘤組織Pim-3與CCL22表達(dá)顯著高于鄰近癌旁組織，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中FOXP3+Treg計數(shù)顯著高于鄰近癌旁組織。Pim-3表達(dá)與CCL22表達(dá)均與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中FOXP3+Treg計數(shù)呈正相關(guān)。
　　3、生存分析
　　1)61例PDAC中隨訪資料完整的患者共54人，失訪7例。54例PDAC患者無病生存率為44.4％(24/54)，總生存率為

8、53.7％(29/54);復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為55.6％(30/24)，病死率為46.3％(25/54)。
　　2) Kaplan-Meier單因素生存分析顯示:高表達(dá)Pim-3及CCL22組與高TDLNTreg組患者無進(jìn)展生存期及總生存期明顯縮短.Cox多因素生存分析顯示TDLNTreg計數(shù)是影響無病生存時間及總生存時間的獨立預(yù)后因子。
　　結(jié)論：
　　腫瘤組織Pim-3與CCL22表達(dá)均與TIL FOXP3+Treg計數(shù)呈

9、正相關(guān);腫瘤組織Pim-3表達(dá)增強(qiáng)，CCL22表達(dá)增強(qiáng)，TDLN Treg計數(shù)升高的患者無進(jìn)展生存期與總生存期均縮短，而TDLN Treg計數(shù)是預(yù)測胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后的獨立風(fēng)險因子。
　　第二部分 Pim-3與CCL22在胰腺癌中表達(dá)的相關(guān)性及調(diào)控關(guān)系研究。
　　目的：
　　分別在人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)CI-55，其對應(yīng)的穩(wěn)定敲除Pim-3的細(xì)胞株P(guān)KD以及人胰腺導(dǎo)管腺癌組織中檢測Pim-3與CCL22表達(dá)，并分析二者之間

10、相關(guān)性;通過體外和體內(nèi)實驗初步探討CCL22與Pim-3之間可能的相互作用關(guān)系。
　　方法：
　　1、準(zhǔn)備高表達(dá)Pim-3的人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞株P(guān)CI55.
　　2、構(gòu)建該細(xì)胞株的Pim3敲除穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株P(guān)KD.
　　3、驗證PKD細(xì)胞株P(guān)im-3表達(dá):分別用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCRreal-timeRT-PCR)與蛋白印跡實驗(we stern blot)驗證Pim-3表達(dá)。同時采用real-timeRT-P

11、CR驗證CCL22表達(dá)。
　　4、收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA檢測以上兩種人胰腺癌細(xì)胞株中CCL22蛋白表達(dá)并定量。
　　5、免疫組化（immunohistochemistry，IHC）方法檢測第一部分中收集的61例胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)本腫瘤組織Pim-3與CCL22表達(dá)并分析其相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1、IHC結(jié)果顯示:PDAC腫瘤組織中Pim-3與CCL22的表達(dá)呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

12、
　　2、real-time RT-PCR結(jié)果顯示:人胰腺腺癌細(xì)胞株P(guān)CI-55的Pim-3與CCL22的mRNA水平均明顯高于PKD細(xì)胞株，差異均有顯著性，且二者之間呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3、Western blot結(jié)果顯示:PCI-55細(xì)胞株P(guān)im-3表達(dá)明顯強(qiáng)于PKD。
　　4、ELISA結(jié)果顯示:PKD細(xì)胞株培養(yǎng)上清液內(nèi)CCL22滴度低于PCI-55細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：