VEGF-D介導(dǎo)TNF-α促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞微淋巴管生成.pdf

1、【目的】原發(fā)性膽囊癌是膽道系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，具有惡性程度高，早期易轉(zhuǎn)移等特點。其早期的淋巴轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-C和VEGF-D與腫瘤的淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此二者又被稱作淋巴管生成因子。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以在體外及動物體內(nèi)促進(jìn)膽囊癌微淋巴管形成，且有部分依賴于膽囊癌細(xì)胞分泌的VEGF-C，但是否也能通過上調(diào) VEGF-D的分泌，進(jìn)而促進(jìn)淋巴管的生成還不明確。因此本研究擬在體

2、外條件下探討TNF-α是否通過上調(diào)膽囊癌細(xì)胞株VEGF-D的表達(dá)來促進(jìn)膽囊癌微淋巴管生成。以期為膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究提供實驗室依據(jù)，為新藥的研究提供作用靶點。
　　【方法】體外培養(yǎng)膽囊癌細(xì)胞，用不同梯度濃度的外源性TNF-α分別刺激三株膽囊癌細(xì)胞（NOZ、GBC-SD及SGC-996）12h及24h，用熒光定量PCR（Real-time PCR）及酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELSIA）法分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測 TNF-α對三株膽囊癌細(xì)

3、胞株（NOZ、GBC-SD及SGC-996）的VEGF-D表達(dá)的影響；采用帶有 VEGF-DsiRNA的慢病毒感染 NOZ細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，用RT-PCR及Western-blot分別從mRNA及蛋白水平檢測其對VEGF-D表達(dá)的干擾效果。建立膽囊癌NOZ細(xì)胞和人真皮淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞HDLEC3D共培養(yǎng)體系，觀察TNF-α對淋巴內(nèi)皮細(xì)胞體外成管的影響，計算淋巴管成管數(shù)量來分析其能否通過上調(diào)VEGF-D分泌促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞微淋巴

4、管生成。
　　【結(jié)果】Real-time PCR及ELISA結(jié)果顯示，當(dāng)TNF-α的刺激濃度在10-50ng/ml范圍時，可呈濃度依賴地促進(jìn)NOZ和GBC-SD細(xì)胞的VEGF-DmRNA及蛋白的表達(dá)，尤以刺激24小時明顯，其各加藥組的VEGF-D mRNA及蛋白的表達(dá)量均高于對照組(均p<0.05)，且各處理組組間VEGF-D的表達(dá)量有明顯差異(均p<0.05)。當(dāng)TNF-α刺激濃度為50ng/ml時，VEGF-D表達(dá)量最高，而當(dāng)

5、刺激濃度上升到100ng/ml時，其表達(dá)量又有所下降。但研究也發(fā)現(xiàn)，TNF-α對膽囊癌SGC-996細(xì)胞的VEGF-D mRNA及蛋白表達(dá)無影響（p>0.05）。用帶有 VEGF-DsiRNA的慢病毒感染 NOZ細(xì)胞72h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90％，用RT-PCR及Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，干擾組的VEGF-D的表達(dá)明顯受到抑制（P<0.05）。NOZ細(xì)胞和HDLEC細(xì)胞3D共培養(yǎng)結(jié)果顯示，VEGF-D干擾組（NOZ

6、/shVEGF-D組）淋巴小管生成的數(shù)量明顯低于空白對照組（NOZ組）及陰性對照組（NOZ/shCTRL組），有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。且TNF-α刺激后，空白對照組、陰性對照組和干擾組的淋巴管生成的數(shù)量均有不同程度的升高，但干擾組升高的幅度明顯低于空白對照組及陰性對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　【結(jié)論】1、低劑量TNF-α能夠從核酸及蛋白質(zhì)水平上促進(jìn)NOZ、GBC-SD膽囊癌細(xì)胞株VEGF-D表達(dá)，并呈時間及濃度