鹽酸小檗堿對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株體外致瘤能力的影響及其納米脂質(zhì)體研制初探.pdf

1、[目的]
　　 中藥黃連主要有效成分鹽酸小檗堿(黃連素)是目前臨床上廣為應(yīng)用的抗炎類(lèi)藥物,但是對(duì)于其抗腫瘤活性研究得還不充分。本研究擬探討鹽酸小檗堿體外抑制人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1的增殖、遷移和侵襲能力及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性。在此基礎(chǔ)上對(duì)鹽酸小檗堿進(jìn)行劑型改造,以比較納米脂質(zhì)體劑型與傳統(tǒng)劑型對(duì)其活性的影響,為納米脂質(zhì)體劑型應(yīng)用于中藥現(xiàn)代化提供線索。
　　 [方法]
　　 酸性水溶劑煎煮法提取中藥黃連中主要成分鹽酸小

2、檗堿,采用薄板層析法和高效液相色譜法進(jìn)行成分鑒定,并用高效液相色譜法測(cè)定黃連中鹽酸小檗堿的含量;不同濃度鹽酸小檗堿處理CNE-1細(xì)胞,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測(cè)定增殖抑制率并計(jì)算出IC50;用Millicell Hanging Cell Culture Inserts法測(cè)定小檗堿對(duì)CNE-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響;用Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)、FITC/PI雙染觀察CNE-1細(xì)胞凋亡情況,熒光分

3、光光度計(jì)比色法測(cè)定Caspase-3的相對(duì)活性;主動(dòng)載藥法制備鹽酸小檗堿納米脂質(zhì)體并用MTT法和Hoechst33258染色法鑒定鹽酸小檗堿納米脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性。
　　 [結(jié)果]
　　 1.自制產(chǎn)品得率為52.25％,熔點(diǎn)為255℃,薄板鑒定其遷移率rate of flow(Rf)=32.25%,對(duì)照品Rf=32.5%:HPLC鑒定結(jié)果顯示樣品和對(duì)照品在T=10min處無(wú)干擾,表明酸性水溶劑煎煮法能夠提到純度較高的鹽酸小

4、檗堿:
　　 2.HPLC法測(cè)定產(chǎn)品中鹽酸小檗堿含量,結(jié)果表明在0.2461ag～2.460μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系,在T=7.88min處無(wú)干擾。本檢測(cè)方法精密度、準(zhǔn)確度及實(shí)驗(yàn)儀器精密度良好,供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定,該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,可作為評(píng)價(jià)鹽酸小檗堿質(zhì)量的依據(jù);
　　 3.鹽酸小檗堿呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性抑制CNE-1細(xì)胞的生長(zhǎng),其作用6、12、18、24、48h后抑制CNE-1細(xì)胞的IC5

5、0值為127.645、97.3323、40.80518、18.06713、11.72524(μg/ml);用5μg/ml、10μg/ml鹽酸小檗堿處理細(xì)胞,24h后呈濃度依賴(lài)性抑制CNE-1細(xì)胞遷移,48h后呈濃度依賴(lài)性抑制CNE-1細(xì)胞的侵襲,在處理6、12、18、24、48h后用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果表明鹽酸小檗堿作用6、12、18h后能誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞發(fā)生早期凋亡,凋亡率分別為(35.0%、58.7%)、(13.9%、

6、31.6%)、(5.1%、30.0%),作用24h后能誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡,凋亡率分別為(33.8%、43.8%),其作用48h后幾乎不能誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞發(fā)生凋亡;5μg/ml、10μg/ml鹽酸小檗堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡6、12、24h后細(xì)胞內(nèi)Caspases-3活性分別為(3.03,6.07),(2.10,3.44),(4.14,6.42);4.鹽酸小檗堿納米脂質(zhì)體藥物含量為0.8mg/ml,外水相最佳pH值為6.8,孵化溫度為

7、60℃,在此制備工藝條件下得到的納米脂質(zhì)體顆粒包封率達(dá)到了83%,粒徑為90nm左右,脂質(zhì)體起到儲(chǔ)存和控制藥物釋放的作用;
　　 5.鹽酸小檗堿納米脂質(zhì)體與鹽酸小檗堿純品相比,細(xì)胞毒性較小,且對(duì)Hep-G2細(xì)胞的抑制作用更明顯。
　　 [結(jié)論]
　　 酸性水溶劑煎煮法提取所得鹽酸小檗堿可誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞凋亡,能夠削弱CNE-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力,具有增殖抑制作用;小檗堿在體內(nèi)的含量會(huì)迅速減少,生物利用度不高;