基于SILAC技術(shù)的PRRSV感染Marc-145細胞分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的造成全球養(yǎng)豬業(yè)嚴重危害的病毒性傳染病，主要臨床表現(xiàn)為妊娠母豬明顯的繁殖障礙以及仔豬嚴重的呼吸系統(tǒng)癥狀和生長遲緩。自1987年首次在北美發(fā)現(xiàn)以來，目前已擴散至全球各大養(yǎng)豬

2、國，并造成了巨大的經(jīng)濟損失，也成為我國重要的地方流行性疾病之一。目前已知PRRSV誘導(dǎo)炎癥因子的大量表達和釋放某些蛋白質(zhì)參與免疫炎癥反應(yīng)，例如PRRSV感染Marc-145細胞和豬肺泡巨噬細胞(PAMs)能誘導(dǎo)高遷移率族蛋白1(HMGB1)的釋放，且能增強PRRSV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。這提示我們細胞外分泌蛋白也在PRRSV的致病機理中發(fā)揮很重要的作用。但目前研究都僅基于對個別已知分泌蛋白的分析，無法對未知分泌蛋白進行分析且缺乏整體性。本研究

3、利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了PRRSV感染Marc-145細胞和未感染狀態(tài)下分泌蛋白圖譜的差異，通過生物信息學(xué)手段對差異蛋白表達譜進行分析并在功能上驗證差異蛋白PRDX3的促炎性因子作用和增強PRRSV誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.PRRSV感染Marc-145細胞的分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　利用細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記(stable isotope labeling with amino acids in cel

4、lcultures，SILAC)技術(shù)，配合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)，對PRRSV感染Marc-145細胞的分泌蛋白表達情況進行了定量檢測和分析。共鑒定出204個差異表達蛋白，包括163個表達上調(diào)的蛋白和41個表達下調(diào)的蛋白。隨后利用生物信息學(xué)技術(shù)對差異表達分泌蛋白的亞細胞定位、生物學(xué)功能進行了分析，并繪制了互作網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)PRRSV感染顯著激活了非經(jīng)典分泌途徑，特別是Exosome介導(dǎo)途徑，例如各種DAMPs的釋放。生物學(xué)

5、功能分析發(fā)現(xiàn)差異表達的蛋白與蛋白結(jié)合和轉(zhuǎn)運、應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控、代謝過程和免疫反應(yīng)等多種生物過程相關(guān)。為了驗證分泌蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性，進一步通過Western blot方法對結(jié)果中的4個差異表達的蛋白進行了檢測，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。
　　2.PRDX3誘導(dǎo)炎癥因子的表達
　　過氧化物酶(peroxiredoxins，Prxs)是一類很重要的內(nèi)源性抗氧化劑。已有報道顯示，細胞外的PRDX1作為促炎性因子與TLR4結(jié)合，激活

6、NF-κB，促進TNF-α和IL-6的分泌。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后促進了PRDX3的分泌，繼而對其可能的促炎性因子作用進行了研究。首先原核表達和純化PRDX3，隨后處理PK-15細胞，通過NF-κB熒光素酶報告系統(tǒng)、Western blot實驗、間接免疫熒光和相對定量PCR發(fā)現(xiàn)，PRDX3可以誘導(dǎo)NF-κB的激活、NF-κB p65亞基的磷酸化和入核、IL-6，IL-8和TNF-α等炎癥因子的表達，說明PRDX3具有促炎性因

7、子的作用。
　　為了探討TLR4是否參與PRDX3誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，將TLR4干擾分子轉(zhuǎn)染PK-15細胞后用PRDX3蛋白處理，通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)干擾TLR4的表達能抑制PRDX3誘導(dǎo)的IL-6，IL-8和TNF-α等炎癥因子的表達。此外，利用PRDX3處理TLR4缺失的HEK-293T細胞則不能誘導(dǎo)NF-κB的激活，而在轉(zhuǎn)染了TLR4超表達質(zhì)粒的HEK-293T細胞上PRDX3可以誘導(dǎo)NF-κB的激活。以上結(jié)果

8、提示TLR4參與PRDX3誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　3.PRDX3參與PRRSV誘導(dǎo)的NF-κB激活和炎癥因子的表達
　　首先，利用間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染Marc-145細胞后，不能改變PRDX3的線粒體定位。隨后采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染能誘導(dǎo)細胞上清中PRDX3的表達，而胞內(nèi)PRDX3則略微下調(diào)。由于PRRSV感染顯著激活了Exosome介導(dǎo)的蛋白分泌途徑和會引起細胞線粒體損傷，溶解，我們

9、推測Exosome在PRRSV誘導(dǎo)PRDX3的分泌中具有重要的作用。
　　隨后，我們檢測發(fā)現(xiàn)PRDX3不影響PRRSV的增殖。但將純化的PRDX3蛋白處理Marc-145細胞，通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)胞外PRDX3能上調(diào)PRRSV誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子的表達。將PRDX3干擾分子轉(zhuǎn)染Marc-145細胞后接種PRRSV，干擾內(nèi)源性的PRDX3促進PRRSV誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α等