多聚磷酸激酶PPK在腸外致病性大腸桿菌PCN033壓力應(yīng)激中的作用研究.pdf

1、大腸桿菌可引起人和動物的腸內(nèi)腸外各種疾病，給畜牧養(yǎng)殖造成重大經(jīng)濟損失并嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。目前，對抗細菌病原主要依靠抗生素和宿主自身免疫系統(tǒng)?？股赝ㄟ^干擾細菌必要的合成代謝發(fā)揮殺菌抑菌作用，而宿主則通過免疫細胞和免疫分子發(fā)揮抗細菌感染作用。正因為此，細菌進化出抵御外界不良環(huán)境的能力，除了環(huán)境選擇使細菌獲得藥物降解、靶點突變或修飾的能力，細菌還會調(diào)控抗性蛋白、外排泵和胞內(nèi)運輸基因表達抵御抗生素損傷;而重要免疫因子過氧化氫刺激時，細菌上

2、調(diào)表達過氧化氫酶、谷還原酶、超氧化物歧化酶等以對抗氧化壓力，細菌的這一能力被稱為“壓力應(yīng)激”。實現(xiàn)壓力應(yīng)激調(diào)控需要將胞外信號通過細胞膜上受體傳遞至胞內(nèi)，改變RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)控相關(guān)基因表達以應(yīng)對不良環(huán)境刺激。在細菌中，四（五）磷酸鳥苷酸ppGpp(p)和多聚磷酸polyP是細菌應(yīng)對不良環(huán)境的重要信號分子。 ppGpp(p)由三磷酸鳥嘌呤焦磷酸合成酶RelA催化GTP焦磷酸化合成，該分子在氨基酸饑餓、碳營養(yǎng)缺乏、紫外線照射、氧

3、化應(yīng)激和滲透壓等壓力應(yīng)激中均發(fā)揮重要作用。polyP由多聚磷酸激酶PPK以ATP和GTP為原料催化合成的高能磷酸多聚物，廣泛存在于微生物細胞中，在細菌中發(fā)揮多種功能，缺失PPK會導(dǎo)致細菌毒力下降、存活能力和運動能力降低、群體感應(yīng)和壓力應(yīng)激損傷。
　　鑒于polyP在壓力應(yīng)激方面的重要作用，本研究構(gòu)建了ppk缺失株△ppk，通過最小抑菌濃度測定、殺菌實驗、基因表達檢測(RNA-seq和qRT-PCR)、生物膜形成分析等方法研究PPK

4、在腸外致病性大腸桿菌PCN033抗生素耐受中的作用;而polyp和ppGpp(p)在過氧化氫耐受中均發(fā)揮基因調(diào)控作用，因此本研究在缺失株△ppk基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙基因缺株△relA-△ppk和RelA缺失株△relA，通過最小抑菌濃度測定、抑菌實驗、qRT-PCR、western blot等方法研究PPK在腸外致病性大腸桿菌PCN033中的相互調(diào)控關(guān)系，得到以下結(jié)果:
　　1.浮游狀態(tài)下，缺失株△ppk較野生株對抗生素敏感
　　

5、依據(jù)抗生素作用靶點，將本研究所選用的抗生素分為四類:破壞細菌細胞壁的β-內(nèi)酰胺類和糖肽類、干擾蛋白質(zhì)合成的氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類、干擾核酸合成的喹諾酮類和硝基呋喃類、破壞細胞膜的肽脂類。MIC分析顯示，缺失株△ppk較野生株對抗生素敏感，尤其是對具有破壞細菌細胞壁功能的β-內(nèi)酰胺類和干擾蛋白質(zhì)合成的氨基糖苷類抗生素敏感?？股貧⒕鷮嶒灲Y(jié)果顯示，浮游狀態(tài)下，缺失株△ppk更容易被抗生素殺死。上述結(jié)果表明PPK參與抗生素耐受。
　　2

6、.RNA-seq和qRT-PCR檢測缺失株△ppk的抗生素耐受相關(guān)基因的表達
　　對未經(jīng)抗生素處理的突變株△ppk和野生株WT進行RNA-seq和qRT-PCR驗證分析，結(jié)果顯示，16個抗性蛋白基因中僅tetB上調(diào)表達;參與抗生素外排的35個基因中下調(diào)表達的基因為marA、marB和mdtA;上調(diào)表達的基因為mdtG和madtE;參與抗生素胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的基因中僅ompC上調(diào)。無抗生素處理時，參與抗生素耐受的相關(guān)基因基因表達在野生株和突

7、變株中沒有顯著性變化。
　　對突變株△ppk和WT進行他唑巴坦和慶大霉素處理，進行qRT-PCR驗證。他唑巴坦處理會導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺類抗性蛋白基因bla(ampC)上調(diào)，同時上調(diào)的基因還有aac，arnA，nfsA;慶大霉素處理對抗性蛋白基因的表達沒有影響，盡管突變株△ppk與WT之間外排基因均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，但沒有顯著性差異。對隨機篩選的外排泵基因進行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示，他唑巴坦和慶大霉素處理均會使acrA、acrD、cu

8、sC、emrA、mdtA和marA顯著性上調(diào)，但突變株△ppk的上調(diào)倍數(shù)低于WT。他唑巴坦處理對水孔蛋白基因表達基本沒有影響，而慶大霉素處理則會導(dǎo)致內(nèi)入基因ompC、ompF和phoE下調(diào)表達，但缺失株△ppk中下降的倍數(shù)顯著低于WT。在抗生素處理條件下，參與抗生素耐受的相關(guān)基因表達在WT和△ppk中具有顯著性差異，說明PPK參與抗生素壓力應(yīng)激是通過接受刺激信號后調(diào)控抗性蛋白、外排泵和胞內(nèi)運輸基因表達實現(xiàn)。
　　3.qRT-PCR

9、驗證polyP對參與抗生素耐受的雙組分系統(tǒng)(TCSs)的激活情況
　　由于抗性蛋白基因bla(ampC)，胞內(nèi)運輸基因ompC, ompF和外排泵基因acrA，acrF, acrD分別受到雙組分調(diào)控系統(tǒng)FimZ，OmpR和PhoB，CpxR，EvgA和TorR的調(diào)控。對參與抗生素耐受的雙組分調(diào)控系統(tǒng)FimZ，EvgA，OmpR，PhoB，BaeR，CpxR，TorR的下游基因ampC, emrKY, ompCF, phoA，tor

10、ACD，mdtAB和degP進行RNA-seq和qRT-PCR驗證。未經(jīng)抗生素時，與野生株相比，F(xiàn)imZ調(diào)控的抗性蛋白基因ampC沒有顯著性變化;BaeR調(diào)控的mdtA顯著性下調(diào)，其他雙組分調(diào)控的下游基因沒有顯著性變化;而OmpR調(diào)控的ompC和ompF表達顯著性上調(diào)。對WT和缺失株△ppk進行慶大霉素處理，同時將敏感性未發(fā)生改變的諾氟沙星作為對照，進行qRT-PCR驗證。結(jié)果表明，諾氟沙星處理，與未處理野生株相比，僅有FimZ下游基因

11、ampC表達上調(diào)，而突變株△ppk內(nèi)表達未有顯著性變化。慶大霉素處理，與未處理野生株WT相比，TorR, BaeR，CpxR下游基因的表達均顯著性上調(diào)，且顯著性高于△ppk過表達polyP合成酶基因ppk會導(dǎo)致FimZ，EvgA，PhoB，TorR，BaeR和CpxR下游基因表達上調(diào)，而過表達polyP外切酶基因ppx則會導(dǎo)致這些雙組分下游基因表達下調(diào)。結(jié)果表明，polyP參與雙組分系統(tǒng)的激活與調(diào)控，并參與抗生素耐受。
　　4.P

12、PK參與生物膜形成且因而影響抗生素耐受
　　剛果紅染色實驗表明，與生物膜形成相關(guān)的胞外多糖等物質(zhì)合成減少，表明△ppk缺失株生物膜形成受損。抗生素未處理條件下，RNA-seq顯示突變株△ppk中參與生物膜形成的鞭毛基因、菌毛基因表達下調(diào);同時，他唑巴坦和慶大霉素處理條件下，盡管鞭毛和菌毛基因的表達趨勢不變，但參與生物膜形成的調(diào)控因子yddV、mcbR和bolA基因在WT中上調(diào)而突變株△ppk中下調(diào)，基因表達結(jié)果與缺失株△ppk生物

13、膜形成受損的表型較為符合，說明PPK參與生物膜合成。MIC結(jié)果顯示，△ppk突變株的生物膜細胞與WT的生物膜細胞具有相同的抗生素敏感性。同時，抗生素清除突變株△ppk和WT生物膜的效率幾乎沒有差異。最后，抗生素殺菌實驗表明，他唑巴坦和慶大霉素對△ppk突變株和WT突變株的生物膜細胞具有相同的殺菌效果。這個結(jié)果說明，生物膜參與抗生素耐受，而PPK不影響細菌生物膜細胞狀態(tài)下的抗生素耐受。
　　5.PPK與RelA均參與過氧化氫耐受且均

14、影響細菌致病能力
　　MIC分析和過氧化氫殺菌實驗表明，缺失株△ppk、缺失株△relA和雙缺失株△ppk-△relA相比于WT對過氧化氫的耐受程度下降。殺菌實驗表明，PPK與RelA協(xié)同參與過氧化氫耐受。盡管過氧化氫處理不會導(dǎo)致WT內(nèi)polyP含量發(fā)生顯著性變化，但是在PPK過表達的菌株中，過氧化氫處理會導(dǎo)致polyP含量顯著性上升，polyP在此過程中發(fā)揮過氧化氫應(yīng)激調(diào)控功能。
　　對野生株、突變株△relA和△ppk進

15、行倍比稀釋，將107、106劑量的細菌進行昆明小鼠攻毒實驗，缺失株△ppk和△relA的小鼠死亡數(shù)目下降、存活時間延長。細菌攻毒實驗表明，PPK和RelA參與細菌致病過程。
　　6.PPK調(diào)控ppGpp(p)合成酶基因relA表達
　　qRT-PCR表明，缺失株△ppk內(nèi)relA表達輕微下調(diào)，在PPK過表達的菌株中，relA表達顯著性上調(diào);同時，Western Blot分析顯示過表達PPK會導(dǎo)致RelA蛋白表達顯著上調(diào)。在P

16、CN033中過表達大腸桿菌本身的PPX不會導(dǎo)致relA下調(diào)，但過表達釀酒酵母超強活性的PPX則會導(dǎo)致relA處于幾乎不表達的狀態(tài)。該結(jié)果表明，發(fā)揮relA基因表達調(diào)控功能的應(yīng)該為polyP分子而非PPK蛋白。說明PPK在relA表達過程中發(fā)揮調(diào)控功能。
　　7.relA基因上游調(diào)控序列TCSs結(jié)合位點預(yù)測與TCSs蛋白表達
　　過表達TCSs反應(yīng)調(diào)控因子，進行熒光定量PCR驗證，發(fā)現(xiàn)多對雙組分系統(tǒng)參與調(diào)控relA基因的表達。

17、對relA基因上游1000bp的序列進行預(yù)測分析，分別找出了雙組分反應(yīng)調(diào)控因子PhoB，OmpR, CpxR，DpiA，BasR，BaeR, TorR，ArcA可能的結(jié)合位點。構(gòu)建EnvZ-OmpR，PhoP-PhoB，CpxA-CpxR，TorS-TorR，BaeS-BaeR, EvgS-EvgA等12個蛋白，進行后續(xù)實驗，以polyP為供體進行體外磷酸化TCSs蛋白，并進行凝膠阻滯實驗，確定TCSs在relA基因上游確定的結(jié)合位點。