GLRaV-Ⅲ RT-PCR檢測(cè)體系及櫻桃砧木莖尖培養(yǎng)技術(shù)的研究.pdf

1、果樹病毒病的致病特點(diǎn)是擴(kuò)散性強(qiáng)，持久性和難以防治性，嚴(yán)重威脅著果樹的生長(zhǎng)發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)第一部分通過對(duì)影響RT-PCR擴(kuò)增因素進(jìn)行研究，建立了葡萄卷葉病毒(GLRaV-Ⅲ)的RT-PCR檢測(cè)體系，并且對(duì)該體系進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。在回收純化GLRaY-Ⅲ擴(kuò)增的特異DNA片段的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行了克隆測(cè)序研究。主要結(jié)果如下： 1.建立了GLRaV-Ⅲ的RT-PCR檢測(cè)體系，進(jìn)一步優(yōu)化了該檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)了高效低成本。結(jié)果表明，要獲得良好的RT-P

2、CR擴(kuò)增，GLRaY-ⅢPCR體系中dNTPs濃度要為100μmol/L，TaqE的用量為1.0U，引物濃度在O.3～1.5μmol/L之間，MgCL2的濃度為0.9mmol/L。退火時(shí)間是60s，退火溫度在52℃～58℃之間，變性溫度達(dá)到94℃，變性時(shí)間是60s，延伸時(shí)間2min，循環(huán)25次。 2.以GLRav-Ⅲ的病毒RNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)獲得了病毒特異擴(kuò)增的部分CPgenecDNA片段，克隆到pUCmT。載體上

3、，構(gòu)建了病毒部分CPgenecDNA的重組質(zhì)粒。序列分析表明，它們的核苷酸序列與國(guó)外已發(fā)表的序列的堿基數(shù)完全相同，進(jìn)一步佐證了RT-PCR檢測(cè)結(jié)果的可靠性。同源性達(dá)到了99.67％。 在果樹脫病毒的研究中，小莖尖結(jié)合熱處理法是目前常用的一種較有效的方法，小莖尖培養(yǎng)體系的建立，是病毒脫除的前提，也是脫毒苗快速繁殖的保證。本實(shí)驗(yàn)第二部分以櫻桃砧木Colt的小莖尖為外殖體進(jìn)行組織培養(yǎng)體系的建立，對(duì)繁殖各個(gè)階段的多種影響因素組合進(jìn)行了系

4、統(tǒng)研究，初步建立了一套較為完整的櫻桃砧木Colt的小莖尖培養(yǎng)體系。在莖尖分化培養(yǎng)中，合適的培養(yǎng)基為1/2MS+1.Omg/LBA+0.1mg/LIBA。在增殖培養(yǎng)中，經(jīng)過篩選得出，最佳培養(yǎng)基為1/2MS+1.Omg/LBA十O.2mg/LIBA+0.5mg/LGA3，增殖倍數(shù)高，植株生長(zhǎng)勢(shì)旺，增殖階段最適的pH值為5.2～6.0。最適的蔗糖濃度是2～3％。生根培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基1/2MS+0.5mg/LIBA上試管苗的生根效果最好，生根率