維甲酸、雷帕霉素對神經膠質瘤細胞中RNA結合蛋白表達的影響.pdf

1、RNA結合蛋白(RNA Binding Protein,RBP)在細胞內與RNA結合,使RNA的結構和功能發(fā)生改變。它們與mRNA前體、mRNA、非編碼RNA相互作用,對RNA的生物合成、選擇性剪接、翻譯、轉運和細胞定位等過程產生影響,在基因的轉錄后水平和翻譯水平起到重要的調控作用。RBP功能涉及到各個生理和病理過程,已經報道部分RBP與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切；實驗室前期工作以人類神經膠質瘤細胞為研究對象,發(fā)現(xiàn)PTB(Polypyrim

2、idine-Tract Binding protein)、PCBP2(Poly(rc)Binding Protein2)等RBPs在神經膠質瘤中高表達。
　　 為了研究抗腫瘤藥對RBP表達的影響,我們選取了全反式維甲酸(All-TransRetinoic Acid,ATRA)和雷帕霉素(rapamycin)兩種藥物。ATRA作用于靶基因啟動子區(qū)的維甲酸應答元件(Retinoic Acid Responding Element,R

3、ARE)調節(jié)基因轉錄,抑制腫瘤細胞增殖、促進分化；而雷帕霉素作用于mTOR(mammalianTarget Of Rapamycin)通路影響基因表達,抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡,產生抗腫瘤作用。
　　 本研究將全反式維甲酸、雷帕霉素以不同的濃度和時間作用于神經膠質瘤細胞(T98G細胞),首先通過MTT實驗、細胞免疫熒光和TUNEL(TdT-mediated dUTPnick end labeling脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導

4、的缺口末端標記)實驗檢測到活細胞數(shù)量減少、分化或凋亡的細胞數(shù)量增多,驗證了兩種藥物對T98G細胞的生物學效應,并為后續(xù)的實驗摸索到了合適的實驗條件和科學的處理方法；進而通過Western Blot檢測了四種RBP即UNR(Upstream of N—Ras)、UNRIP(UNR-Interacting Protein)、PCBP2和PTB的表達變化,其中UNR、UNRIP、PCBP2的表達隨藥物作用時間的延長或藥物濃度的增加逐漸下調,提

5、示UNR、UNRIP、PCBP2可能為抗腫瘤藥物作用通路的下游靶蛋白。
　　 為了通過拯救實驗,進一步驗證RBP和藥物作用后神經膠質瘤細胞產生生物學效應的關系,因此對UNR、UNRIP、PCBP2的真核表達載體進行鑒定及轉染效率測定；另外,為了研究全反式維甲酸、雷帕霉素是否通過翻譯水平機制使RBP下調,對UNR,UNRIP的5’端非編碼區(qū)(Untranslated Region,UTR)內部核糖體進入位點序列(Internal

6、Ribosome Entry Sites,IRES)進行克隆并將其連接到雙順反子熒光載體。雙順反子載體上帶有海腎(Renilla)、螢火蟲(Firefly)兩種熒光編碼基因,但只有海腎熒光編碼基因前有啟動子區(qū)及5’UTR的編碼序列,因此將其表達后僅顯示海腎熒光。實驗中將RBP的5’UTR IRES連接到兩種熒光編碼基因之間后,因IRES具有類似tRNA的三葉草結構,可以直接與核糖體結合、起始螢火蟲熒光編碼基因翻譯。雙順反子熒光載體的構建

7、為進一步研究全反式維甲酸和雷帕霉素是否通過IRES對RBP產生調控奠定了基礎。
　　 以上實驗結果表明,全反式維甲酸、雷帕霉素作用于T98G細胞,可以抑制細胞增殖、促進分化或誘導凋亡；UNR、UNRIP、PCBP2隨藥物作用時間的延長或藥物濃度的增加表達逐漸下調。UNR、UNRIP、PCBP2的真核表達載體和5’UTR IRES雙順反子熒光載體可用于進一步驗證RBP和藥物作用后神經膠質瘤細胞產生生物學效應的關系及其分子機制。上述