神經膠質瘤細胞ATF5表達水平對HCMV復制的影響機制的研究.pdf

1、目的：⑴檢測人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)基因及轉錄激活因子5（ATF5）在神經膠質瘤細胞U87、SY5Y及A172中的表達水平,為探討HCMV在神經膠質瘤細胞中的增殖機制奠定一定的分子生物學基礎。⑵下調ATF5在神經膠質瘤細胞U87、SY5Y中的表達水平，探討神經膠質瘤細胞ATF5表達水平對HCMV復制水平的影響。
　　方法：①用HCMV AD169(MOI=5)分別感染U87、SY5Y及A

2、172細胞,用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。②用HCMV AD169(MOI=5)分別感染U87、SY5Y及A172細胞分別在24、48、72、96、120 h取各時間點上清液，收集上清后通過空斑定量的方法檢測病毒滴度。③Real-time PCR檢測HCMV即刻早期基因(IE2)、早期基因(UL44)、晚期基因(UL99)及ATF5的表達情況，Western-blot（WB）檢測病毒基因編碼的蛋白及ATF5表達的情況。④通過慢病毒為載體

3、的RNA干擾技術，來下調ATF5在膠質瘤細胞U87、SY5Y中的表達，在熒光顯微鏡下觀察慢病毒的感染效率，WB檢測ATF5蛋白干擾的效率，選擇出最佳感染條件和感染參數(shù)。⑤下調ATF5在U87、SY5Y細胞中表達后，再用HCMV感染U87、SY5Y細胞,Real-time PCR及WB檢測檢測HCMV基因及蛋白的表達水平。
　　結果：⑴HCMV感染U87、SY5Y、A172后觀察細胞形態(tài)變化，HCMV感染第3-4天U87、SY5Y細

4、胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的變化，細胞觸角由細長變粗鈍，細胞由瘦變粗圓，細胞之間變得更為聚合，而A172組細胞則無明顯變化。⑵HCMV感染U87、SY5Y、A172收集不同時間點的上清，空斑定量檢測病毒滴度，其中將U87、SY5Y細胞收集的上清液加入接種HELF的24孔板中，加24、48 h收集的上清液的孔未出現(xiàn)變化，加72 h收集的上清液的孔可檢測到空斑且隨時間延長空斑數(shù)增多，加120 h收集的上清液的孔空斑數(shù)量最多病毒滴度最高；而收集A172細

5、胞上清液加入接種HELF的24孔板中則無明顯變化。⑶Real-time PCR及WB檢測顯示，HCMV在U87、SY5Y細胞中復制水平與病毒在A172細胞中復制水平相比，U87、SY5Y細胞組明顯高于A172細胞組（P<0.05），ATF5表達在U87、SY5Y細胞組與A172細胞組相比，U87、SY5Y細胞組ATF5表達明顯高于A172組（P<0.05）。⑷HCMV感染U87、SY5Y兩組細胞后，Pearson相關分析結果顯示，IE2

6、與ATF5表達具有明顯正相關性，U87（r=0.955,P<0.05），SY5Y(r=0.956,P<0.05)。⑸在Complete Medium+5μg/ml Polybrene條件下 U87（MOI=1）、SY5Y(MOI=15)慢病毒感染效率最高，在感染后72h時熒光顯微鏡下可見紅色熒光蛋白，轉染效率可達95％，WB檢測各組ATF5表達，其中U87細胞未處理組、陰性對照CON053組和LV-ATF5-RNAi組ATF5的相對表達

7、量分別為0.31±0.02、0.29±0.02、0.07±0.03，SY5Y細胞未處理組、陰性對照CON053組和LV-ATF5-RNAi組ATF5的相對表達量分別為0.29±0.01、0.28±0.04、0.06±0.03。⑹以慢病毒為載體的RNA干擾技術下調ATF5在U87、SY5Y細胞的表達，用HCMV感染細胞檢測HCMV基因以及蛋白的表達水平，結果ATF5表達下調可抑制HCMV的復制（P<0.05）。
　　結論：①HCMV