神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ATF5表達(dá)水平對(duì)HCMV復(fù)制的影響機(jī)制的研究.pdf

1、目的：⑴檢測人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)基因及轉(zhuǎn)錄激活因子5（ATF5）在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、SY5Y及A172中的表達(dá)水平,為探討HCMV在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的增殖機(jī)制奠定一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。⑵下調(diào)ATF5在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、SY5Y中的表達(dá)水平，探討神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ATF5表達(dá)水平對(duì)HCMV復(fù)制水平的影響。
　　方法：①用HCMV AD169(MOI=5)分別感染U87、SY5Y及A

2、172細(xì)胞,用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。②用HCMV AD169(MOI=5)分別感染U87、SY5Y及A172細(xì)胞分別在24、48、72、96、120 h取各時(shí)間點(diǎn)上清液，收集上清后通過空斑定量的方法檢測病毒滴度。③Real-time PCR檢測HCMV即刻早期基因(IE2)、早期基因(UL44)、晚期基因(UL99)及ATF5的表達(dá)情況，Western-blot（WB）檢測病毒基因編碼的蛋白及ATF5表達(dá)的情況。④通過慢病毒為載體

3、的RNA干擾技術(shù)，來下調(diào)ATF5在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、SY5Y中的表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察慢病毒的感染效率，WB檢測ATF5蛋白干擾的效率，選擇出最佳感染條件和感染參數(shù)。⑤下調(diào)ATF5在U87、SY5Y細(xì)胞中表達(dá)后，再用HCMV感染U87、SY5Y細(xì)胞,Real-time PCR及WB檢測檢測HCMV基因及蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：⑴HCMV感染U87、SY5Y、A172后觀察細(xì)胞形態(tài)變化，HCMV感染第3-4天U87、SY5Y細(xì)

4、胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的變化，細(xì)胞觸角由細(xì)長變粗鈍，細(xì)胞由瘦變粗圓，細(xì)胞之間變得更為聚合，而A172組細(xì)胞則無明顯變化。⑵HCMV感染U87、SY5Y、A172收集不同時(shí)間點(diǎn)的上清，空斑定量檢測病毒滴度，其中將U87、SY5Y細(xì)胞收集的上清液加入接種HELF的24孔板中，加24、48 h收集的上清液的孔未出現(xiàn)變化，加72 h收集的上清液的孔可檢測到空斑且隨時(shí)間延長空斑數(shù)增多，加120 h收集的上清液的孔空斑數(shù)量最多病毒滴度最高；而收集A172細(xì)

5、胞上清液加入接種HELF的24孔板中則無明顯變化。⑶Real-time PCR及WB檢測顯示，HCMV在U87、SY5Y細(xì)胞中復(fù)制水平與病毒在A172細(xì)胞中復(fù)制水平相比，U87、SY5Y細(xì)胞組明顯高于A172細(xì)胞組（P<0.05），ATF5表達(dá)在U87、SY5Y細(xì)胞組與A172細(xì)胞組相比，U87、SY5Y細(xì)胞組ATF5表達(dá)明顯高于A172組（P<0.05）。⑷HCMV感染U87、SY5Y兩組細(xì)胞后，Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，IE2

6、與ATF5表達(dá)具有明顯正相關(guān)性，U87（r=0.955,P<0.05），SY5Y(r=0.956,P<0.05)。⑸在Complete Medium+5μg/ml Polybrene條件下 U87（MOI=1）、SY5Y(MOI=15)慢病毒感染效率最高，在感染后72h時(shí)熒光顯微鏡下可見紅色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)95％，WB檢測各組ATF5表達(dá)，其中U87細(xì)胞未處理組、陰性對(duì)照CON053組和LV-ATF5-RNAi組ATF5的相對(duì)表達(dá)

7、量分別為0.31±0.02、0.29±0.02、0.07±0.03，SY5Y細(xì)胞未處理組、陰性對(duì)照CON053組和LV-ATF5-RNAi組ATF5的相對(duì)表達(dá)量分別為0.29±0.01、0.28±0.04、0.06±0.03。⑹以慢病毒為載體的RNA干擾技術(shù)下調(diào)ATF5在U87、SY5Y細(xì)胞的表達(dá)，用HCMV感染細(xì)胞檢測HCMV基因以及蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果ATF5表達(dá)下調(diào)可抑制HCMV的復(fù)制（P<0.05）。
　　結(jié)論：①HCMV