腸道病毒71型的生物信息學分析及其Oligo探針設(shè)計.pdf

1、腸道病毒71型(enterovirus type 71,簡稱EV71)是手足口病(hand foot andmouth disease,HFMD)的主要病原體,其感染性強且致病率高,可以導致手足口病、無菌性腦膜炎(Asepicmeningitis)、腦炎(Encephalitis)和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹性疾病(Poliomyelitis-like paralysis)等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。EV71傳染性強,常見全家發(fā)病,并可造成局部暴發(fā)流行

2、?；颊咭?～5歲以下小兒多見,成人也可患病,但病情多較輕。一年四季均可發(fā)病,以5、6月份為多發(fā)。潛伏期2～5日。傳播途徑不僅是糞-口傳播,病毒主要通過人群間的密切接觸進行傳播,人群密集處易發(fā)生病毒的流行,幼托機構(gòu)內(nèi)的學齡前兒童是感染的高危人群。進入21世紀以來EV71引起的手足口病疫情在我國及世界多個國家和地區(qū)多次大規(guī)模出現(xiàn),對人類健康、經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定造成了嚴重的危害。
　　 EV 71可感染免疫缺陷者、新生兒及幼兒,造成嚴

3、重后果,甚至威脅生命。由于是EV71引起的手足口病,與柯薩奇A組和B組的一些病毒引起的手足口病在臨床上難以區(qū)分,而且Cox16爆發(fā)往往伴隨著EV71的流行,而且EV71可引起的臨床癥狀與其他病毒引起的初期癥狀極為相似,因此EV 71是所有腸道病毒中最難鑒定的病毒之一。因此早期、快速、準確的診斷對EV71的預防和隔離至關(guān)重要。目前常用的實驗室診斷方法包括病毒分離培養(yǎng)、免疫學方法、PCR技術(shù)等,但分別存在難以早期診斷、敏感度低或假陽性率高等

4、缺陷。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,基因芯片技術(shù)因其具有高通量性、快速、準確性強等特點,成為新興的病毒檢測技術(shù)。本課題研究借助生物信息學技術(shù)和探針設(shè)計軟件,探索對EV71病毒感染的早期、敏感、準確和快速檢測的探針設(shè)計,為以后打印成適用的基因檢測芯片打下基礎(chǔ)。
　　 基因芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新型、高效、快速、敏感的核酸分析與檢測方法,基因芯片技術(shù)因其具有高通量性、快速、準確性強等特點,成為新興的病毒檢測技術(shù)。目前國內(nèi)尚無使用基

5、因芯片對腸道病毒進行檢測的相關(guān)報道。鑒于腸道病毒引發(fā)疾病的早期診斷對后期的疾病防治工作意義重大,可使用基因芯片技術(shù)針對并發(fā)癥較嚴重之EV 71、Cox A15、Cox A16、Cox B3等多種腸道病毒的特定基因序列所設(shè)計出檢測芯片快速診斷腸道病毒感染的具體類型,及時制定治療措施,提高疾病防治水平。因此使用基因芯片技術(shù)對腸道病毒進行聯(lián)合檢測的臨床應用前景非常廣闊。
　　 近年來迅速發(fā)展的長鏈寡核苷酸基因芯片技術(shù)(60-70 me

6、r OligoMicroarray),為從基因水平高度特異性的檢測EV71提供了可能。長鏈寡核苷酸探針用作基因芯片探針是近年來在基因芯片研究領(lǐng)域出現(xiàn)的一項新技術(shù),生物信息學研究表明,一條長鏈寡核苷酸即可代表一個基因,同時又具有較高的特異性,因此,長鏈寡核苷酸探針集傳統(tǒng)cDNA和短鏈寡核苷酸探針的優(yōu)點于一身,在一定程度上克服了傳統(tǒng)探針的缺點,是制作EV71檢測芯片最合適的選擇。
　　 通過生物信息學研究分析基因芯片探針是一種簡便,

7、經(jīng)濟的方法,運用生物信息學工具對基因芯片探針進行設(shè)計可以大大減少花費時間、提高工作效率。運用生物信息學方法從核酸數(shù)據(jù)庫中取得基因序列,然后通過序列比對分析,找出其特征序列,作為探針設(shè)計的參照序列。序列比對分析是生物信息學中最常用的方法,生物信息學中常用的核酸序列搜索比較算法是BLAST。各種亞型的基因組序列存在堿基插入、缺失和替換而導致的細微差別。利用多重序列比較可以發(fā)現(xiàn)基因序列中相對保守的區(qū)域,因此可以選擇這段保守區(qū)作為芯片設(shè)計的參考

8、序列。用生物信息學探針設(shè)計軟件分析保守序列即可獲得特異探針。
　　 本研究首先確立了長鏈寡核苷酸基因芯片實驗的基本條件,以保證各種參數(shù)盡量控制在最佳范圍,以保證在同一張芯片上的探針在相同的雜交、清洗條件下得到最佳的雜交效果,并確定了用于寡核苷酸芯片雜交檢測所需要的最佳探針片段長度。長鏈寡核苷酸探針序列長度一般在60-170 mer,60mer的探針盡管合成成本較低,但特異性及固定率均不如70 mer長度的探針:由于70 mer的

9、寡核苷酸芯片能兼顧雜交的特異性和信號強度,已經(jīng)被越來越多的實驗室所接受。
　　 本研究首先登錄NCBI(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫通過搜索獲得最新的EV71基因組全長序列,然后將病毒的基因組全長序列使用NCBI的在線BLAST(Basic local alignment search tool)功能進行BLAST比對分析,結(jié)果獲得EV71的

10、保守序列及型特異性序列,作為設(shè)計Oligo探針的備選序列。
　　 利用生物學軟件Oligo 6.71分別對BLAST檢索所得病毒的種屬保守序列和型特異性序列逐一進行分析,設(shè)計長度均一的70 mer的Oligo探針,并對其進行BLAST比對,為減少非特異性雜交,保證芯片雜交的敏感度和精確度,采用了嚴格的遴選標準,從中篩選出特異性較高的12條探針,作為制備EV71寡核苷酸檢測基因芯片的首選探針序列。本研究使用生物信息學方法對EV71

11、的基因序列進行比對,得到有意義的特異序列；用生物學軟件Oligo 6.71為基因芯片設(shè)計特異性高、Tm值相近、長度均一的Oligo探針,為基因芯片在臨床診斷中的應用作出了貢獻。
　　 本課題通過實驗室研究,得到的實驗結(jié)果如下:
　　 1、使用基因芯片技術(shù)對EV71進行診斷,其主要優(yōu)點是可以同時檢測多段基因,而且具有較高的靈敏度。同時,由于分子雜交本身即具有較高的嚴謹性,應用多組探針聯(lián)合判斷檢測結(jié)果,也可以有效的降低檢測的

12、假陽性率。此外,因基因芯片本身具備高通量大規(guī)模的特點,將基因芯片用于鑒別診斷最有優(yōu)勢,可以將多種與EV71早期癥狀類似的病毒如柯薩奇、皰疹病毒、埃可病毒、輪狀病毒等常見病原體點樣到芯片上進行聯(lián)合診斷,對于確診病人、排除疑似患者具有重要意義。設(shè)計出能與靶分子特異結(jié)合的探針是準確檢測病毒基因的關(guān)鍵。用于病原體檢測或診斷的寡核苷酸探針可針對病原體基因的保守序列或是與疾病相關(guān)的特異基因來進行設(shè)計。長鏈寡核苷酸探針序列長度一般在60-70 mer

13、,60mer的探針盡管合成成本較低,但特異性及固定率均不如70 mer長度的探針；由于70 mer的寡核苷酸芯片能兼顧雜交的特異性和信號強度,在本研究中我們采用了70 mer的探針序列。
　　 2、本研究首先直接通過生物信息學軟件從網(wǎng)上GenBank等數(shù)據(jù)庫調(diào)取目標序列,然后構(gòu)建分析項目,再分別對各基因的基因序列進行全長比對,通過比對后再進行探針設(shè)計就能避免探針的交叉同源性。在進行探針設(shè)計時可據(jù)比對結(jié)果剔除同源性高的區(qū)段,低的區(qū)

14、段再行二次甚至三次比對,并選擇再次比對結(jié)果中相似性分選擇再次比對結(jié)果中相似性分數(shù)值<40的區(qū)段作為特異性序列。這些特異性序列和GenBank國際數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)中其他現(xiàn)有全部序列的同源性最低,可大大減少非特異性雜交,提高檢測的精確度及BLAST分析的效率。
　　 3、在用Oligo 6.71對探針進行設(shè)計時,選擇70 mer長度均一的Oligo作為探針可使雜交條件趨向均一,靈敏度增高。對備選探針進行篩選時,各種參數(shù)盡量控制在最佳范圍,

15、以保證同一張芯片上的探針在相同的雜交、清洗條件下得到最佳的雜交效果。探針最穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的配對堿基長度小于6 bp,G趨于0或為正值,保證探針內(nèi)部不會形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)而影響探針與芯片雜交的效率。本研究利用NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫的BLAST功能及生物學軟件Oligo 6.71成功設(shè)計特異性高、長度一致、融解溫度相近的Oligo探針12條,為后期合成基因芯片,用于EV71的檢測打下了基礎(chǔ),可以較好的用于進一步的芯片實驗階段。<