PKD1表達(dá)下調(diào)在主動(dòng)脈夾層形成中的作用機(jī)制研究.pdf

1、主動(dòng)脈夾層(aortic dissection，AD)是累及主動(dòng)脈的災(zāi)難性疾病，一旦破裂致死率極高。近年來(lái)在我國(guó)和世界范圍內(nèi)，AD的發(fā)病率和檢出率正逐年上升，消耗了大量的醫(yī)學(xué)資源與社會(huì)財(cái)富。既往研究表明，高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、吸煙等諸多因素與AD的發(fā)生相關(guān)，但目前仍缺乏具有說(shuō)服力的發(fā)病假說(shuō)和機(jī)理，其確切的發(fā)病機(jī)制仍未徹底研究清楚。
　　 大量病理研究顯示，AD患者的主動(dòng)脈中膜存在不同程度的平滑肌細(xì)胞(smooth muscle

2、cell，SMC)壞死、凋亡及表型轉(zhuǎn)化，并伴有細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分異常和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)表達(dá)上調(diào)，這提示主動(dòng)脈壁的結(jié)構(gòu)改變可能是AD發(fā)病的始動(dòng)因素，而高血壓等外因在管壁結(jié)構(gòu)失衡的基礎(chǔ)上，加速或者促進(jìn)了AD的發(fā)生。
　　 多囊腎病基因-1(PKD1)編碼的蛋白產(chǎn)物為多囊蛋白-1(polycystin-1，PC-1)，后者參與細(xì)胞黏

3、附和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。國(guó)外學(xué)者在采用PKD1敲除的小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)：PKD1的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致了模型小鼠的主動(dòng)脈形成潛在間隙和壁間血腫等一系列類似AD發(fā)生前的結(jié)構(gòu)改變。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)AD患者主動(dòng)脈中膜的PKD1表達(dá)顯著下調(diào)。因此本課題在組織水平和細(xì)胞水平探索PKD1表達(dá)下調(diào)、SMC表型轉(zhuǎn)化、ECM代謝異常與AD形成之間的關(guān)系，以闡明PKD1表達(dá)下調(diào)促進(jìn)AD發(fā)生的機(jī)制，為AD的早期診斷、治療與預(yù)防奠定理論基礎(chǔ)，推動(dòng)更深一步的研究。

4、r>　　 第一部分主動(dòng)脈夾層胸主動(dòng)脈中膜SMC表型和ECM代謝的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:
　　 觀察及評(píng)估夾層累及的胸主動(dòng)脈中膜和正常胸主動(dòng)脈中膜在SMC表型、ECM成分和MMP表達(dá)上的差異。
　　 方法:
　　 采集AD患者的病變胸主動(dòng)脈標(biāo)本和正常成人胸主動(dòng)脈標(biāo)本各18例，分為AD組和正常組，兩組的性別構(gòu)成比相同且平均年齡無(wú)顯著差異(P>0.05)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和Western blot檢測(cè)

5、兩組標(biāo)本中膜的SMC表型蛋白的表達(dá)，透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察SMC的超微結(jié)構(gòu)，特殊病理染色、免疫組織化學(xué)染色及Western blot測(cè)定中膜彈性蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白、MMP-1和MMP-2的含量。
　　 結(jié)果:
　　 與正常組相比：①免疫組織化學(xué)染色和Western blot顯示AD組中膜的平滑肌α-肌動(dòng)蛋白(smooth muscleα-actin，

6、α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重鏈-2(smoothmuscle myosin heavy chain2，SM-MHC-2)、Smoothelin及Calponin(均為SMC收縮表型的標(biāo)志蛋白)的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而骨橋蛋白(osteopontin，OPN))和非肌型肌球蛋白重鏈(non-muscle myosin heavy chain B，SMemb)(均為SMC合成表型的標(biāo)志蛋白)的表達(dá)顯著增加(P<0.01)。②透射

7、電鏡顯示在病變胸主動(dòng)脈中膜內(nèi)，SMC失去典型的長(zhǎng)梭形，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等合成蛋白的細(xì)胞器，肌絲、密體等收縮結(jié)構(gòu)則明顯減少或消失。③Masson染色和Gomori氏染色顯示膠原纖維大量沉積于病變胸主動(dòng)脈中膜，而彈力纖維出現(xiàn)斷裂、減少和消失；免疫組化染色顯示病變中膜的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量顯著增加(P<0.01)。④免疫組化和Western blot結(jié)果顯示，MMP-2在病變中膜的表達(dá)量顯著增加(P<0.01)，而MMP

8、-1的表達(dá)量與正常組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 在AD患者的病變胸主動(dòng)脈中膜，SMC的表型從收縮型向合成型轉(zhuǎn)化。在SMC表型轉(zhuǎn)化的同時(shí)亦伴有彈性蛋白的顯著降解、膠原蛋白的大量沉積和MMP-2的表達(dá)上調(diào)。
　　 第二部分正常和病變胸主動(dòng)脈中膜SMC的體外培養(yǎng)及鑒定
　　 目的:
　　 從AD患者的病變胸主動(dòng)脈及正常胸主動(dòng)脈中分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定中膜SMC，建立簡(jiǎn)單有效的原

9、代SMC培養(yǎng)體系。
　　 方法:
　　 病變胸主動(dòng)脈標(biāo)本和正常成人胸主動(dòng)脈標(biāo)本各18例(即第一部分實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本)，隨機(jī)分成酶消組、貼塊組和改良貼塊組，每組病變和正常標(biāo)本各6例，分別采用酶消法、組織貼塊法及改良組織貼塊法分離和培養(yǎng)中膜SMC。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)每組細(xì)胞活力，免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定每組細(xì)胞純度。
　　 結(jié)果:
　　 ①酶消組正常中膜SMC的培養(yǎng)成功率為50％(3/6)，病變中膜SMC則無(wú)一例培養(yǎng)成

10、功(0/6)；貼塊組正常中膜SMC的培養(yǎng)成功率為100％(6/6)，病變中膜SMC的培養(yǎng)成功率為66.7％(4/6)；改良貼塊組正常和病變中膜SMC的培養(yǎng)成功率均為83.3％(5/6)。②酶消法培養(yǎng)原代SMC，5～6d后即可傳代；經(jīng)改良組織貼塊法培養(yǎng)的原代SMC，從細(xì)胞萌出至融合傳代需10～12d；組織貼塊法的細(xì)胞培養(yǎng)周期需4w。③三組正常中膜的原代SMC均表現(xiàn)為典型的長(zhǎng)梭形或三角形，胞漿豐富，生長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)呈現(xiàn)出“峰谷”樣排列，傳代

11、后的細(xì)胞形態(tài)和排列與原代細(xì)胞保持一致；而通過(guò)貼塊法和改良貼塊法獲得的病變中膜原代SMC，其大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)與正常SMC無(wú)異，但部分細(xì)胞表現(xiàn)為卵圓形或多邊形的特殊形態(tài)，胞質(zhì)疏松，在傳代后的細(xì)胞系中亦可見(jiàn)到特殊形態(tài)的SMC聚集。④三組正常中膜SMC的vWF和CD90/Thy-1染色均為陰性，α-SMA染色平均陽(yáng)性率均>95％(P>0.05)，OPN染色平均陽(yáng)性率均<10％(P>0.05)；在貼塊組和改良貼塊組中，病變中膜SMC的α-SMA染色

12、平均陽(yáng)性率分別為16±2.6％和15±3.1％(P>0.05)，OPN染色平均陽(yáng)性率分別為85±4.3％和88±1.7％(P>0.05)，vWF和CD90/Thy-1染色亦均為陰性。
　　 結(jié)論:
　　 與傳統(tǒng)的酶消法和組織貼塊法相比，改良組織貼塊法是簡(jiǎn)單、有效的AD和正常主動(dòng)脈中膜SMC的培養(yǎng)方法，所獲得的原代SMC可在體外連續(xù)傳代，且無(wú)血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的污染。與正常中膜SMC相比，體外培養(yǎng)的部分病變中膜SMC

13、表現(xiàn)為特殊的細(xì)胞形態(tài)。
　　 第三部分主動(dòng)脈夾層胸主動(dòng)脈中膜SMC表型轉(zhuǎn)化影響ECM代謝的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:
　　 體外鑒定正常和病變中膜SMC的表型，并評(píng)估兩組SMC在膠原蛋白合成和MMP表達(dá)上的差異。
　　 方法:
　　 采集AD患者的病變胸主動(dòng)脈標(biāo)本和正常成人胸主動(dòng)脈標(biāo)本各6例(即第一部分實(shí)驗(yàn)標(biāo)本)，通過(guò)改良貼塊法建立SMC細(xì)胞系，分成AD組和正常組，每組細(xì)胞系各6例。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩

14、組SMC的體外增殖速度和DNA合成能力，免疫熒光染色、Western blot、real-time RT-PCR檢測(cè)SMC表型蛋白的表達(dá)，TEM觀察體外培養(yǎng)的SMC的超微結(jié)構(gòu)，脯氨酸摻入法測(cè)定SMC的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白合成量，Western blot檢測(cè)SMC的MMP-1和MMP-2的表達(dá)量。
　　 結(jié)果:
　　 與正常組SMC相比：①AD組SMC的體外增殖能力顯著提高(P<0.01)。②AD組SMC的α-SMA、SM-

15、MHC-2及Smoothelin在mRNA水平和蛋白水平上的表達(dá)量均顯著減少(P<0.01)，而OPN的表達(dá)量顯著增加(P<0.01)。③AD組SMC的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體明顯增多、擴(kuò)張，肌絲則顯著減少或消失。④AD組SMC的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白合成量顯著增加(P<0.01)。⑤AD組SMC的MMP-2表達(dá)量顯著增加(P<0.01)，而MMP-1的表達(dá)量與正常組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)

16、果一致，體外培養(yǎng)的AD主動(dòng)脈中膜SMC也顯示了從收縮表型向合成表型的轉(zhuǎn)化。隨著SMC表型轉(zhuǎn)化，其膠原蛋白的合成及MMP-2的表達(dá)增加。
　　 第四部分 PKD1表達(dá)下調(diào)影響SMC表型的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:
　　 體內(nèi)外檢測(cè)PKD1在正常和病變主動(dòng)脈中膜SMC內(nèi)的表達(dá)，評(píng)估PKD1表達(dá)下調(diào)對(duì)SMC表型、膠原蛋白合成和MMP-2表達(dá)的影響。
　　 方法:
　　 AD患者的病變胸主動(dòng)脈標(biāo)本和正常成人胸

17、主動(dòng)脈標(biāo)本各18例(即第一部分實(shí)驗(yàn)標(biāo)本)，分成AD組和正常組，免疫組織化學(xué)染色和Western blot檢測(cè)兩組中膜的PKD1表達(dá)。通過(guò)改良貼塊法建立SMC細(xì)胞系，分為對(duì)照組、AD組和干擾組，對(duì)照組和干擾組SMC來(lái)源于正常中膜，AD組SMC來(lái)源于病變中膜，每組細(xì)胞系各4例。篩選有效消減內(nèi)源性PKD1的RNA干擾(RNA interference，RNAi)片段，包裝入慢病毒載體構(gòu)建PKD1干擾工具，轉(zhuǎn)染干擾組SMC，檢測(cè)SMC內(nèi)的PKD

18、1消減效率。通過(guò)Western blot、real-time RT-PCR和脯氨酸摻入法檢測(cè)對(duì)照組、AD組以及PKD1干擾后的干擾組SMC的表型蛋白和MMP-2的表達(dá)、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的合成。
　　 結(jié)果:
　　 (1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，AD組中膜PKD1的表達(dá)量顯著減少(P<0.01)。(2)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組SMC相比，PKD1干擾后的干擾組SMC內(nèi)：①PKD1的表達(dá)量顯著減少(P<0.01)

19、；②α-SMA、SM-MHC-2和Smoothelin的表達(dá)量均顯著減少(P<0.01)，而OPN的表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；③Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的合成顯著增多(P<0.01)；④MMP-2的表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；與AD組SMC相比，PKD1干擾后的干擾組SMC內(nèi)：①PKD1表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；②α-SMA和Smoothelin的表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)，OPN的表達(dá)量顯著減少(P<0.01)，SM-

20、MHC-2在mRNA水平上的表達(dá)量差別不顯著(P>0.05)，在蛋白水平上的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；③Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的合成顯著減少(P<0.01)；④MMP-2的表達(dá)量顯著減少(P<0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 與正常主動(dòng)脈中膜SMC相比，AD主動(dòng)脈中膜SMC內(nèi)的PKD1表達(dá)顯著降低。體外干擾正常中膜SMC內(nèi)的PKD1表達(dá)后，和AD中膜SMC相似，正常中膜SMC也發(fā)生了從收縮表型向合成表型的轉(zhuǎn)化，其膠原蛋