人膽囊癌SP細(xì)胞的分選、鑒定及TGF-β對其豐度的影響和機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：在人膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD中檢測、分選SP細(xì)胞亞群，并檢測該群細(xì)胞與干細(xì)胞相關(guān)的生物學(xué)特性。
　　 方法：采用熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)（FACS）從人膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD中檢測、分選人膽囊癌SP細(xì)胞、非SP細(xì)胞；利用Transwell 侵襲小室模型檢測SP、非SP細(xì)胞侵襲能力，通過MTT 方法檢測化療藥物對SP、非SP細(xì)胞生長抑制的影響；通過定量PCR檢測SP、非SP細(xì)胞ABC 家族中4 種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋

2、白（ABCA2，MDR1，MRP1和ABCG2）的表達(dá)；通過流式技術(shù)分析SP、非SP細(xì)胞與4 種干細(xì)胞標(biāo)記物（CD24，CD34，CD44和CD133）的關(guān)系；利用體內(nèi)、外成瘤實(shí)驗(yàn)檢測兩種細(xì)胞亞群的成瘤特性，并通過FACS 檢測新鮮人膽囊癌組織中SP細(xì)胞的表達(dá)。
　　 結(jié)果:人膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD中存在少量的SP細(xì)胞，約占總體細(xì)胞比例的0.87％；SP細(xì)胞較非SP細(xì)胞具有高的侵襲能力、耐藥特性，并高表達(dá)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；體內(nèi)

3、、外實(shí)驗(yàn)證明SP細(xì)胞具有強(qiáng)的致瘤能力，并可再生SP和非SP細(xì)胞，且再生的SP細(xì)胞的比例與分選前GBC-SD細(xì)胞中SP 比例相似；7例人膽囊癌組織中也包含著不同比例的SP細(xì)胞亞群。
　　 結(jié)論:人膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD中SP細(xì)胞亞群具有類似干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　 第二部分
　　 目的:檢測TGF-β誘導(dǎo)的EMT對人膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD中SP細(xì)胞表達(dá)的影響，為下一步研究其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:

4、在體外培養(yǎng)的GBC-SD細(xì)胞中加入TGF-β后，相差倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，通過RT-PCR、Western blotting 檢測E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白水平表達(dá)；并通過MTT 檢測發(fā)生EMT的GBC-SD細(xì)胞對3 種化療藥物吉西他濱、米托蒽醌和表柔比星的敏感性；通過FACS和定量PCR分別檢測GBC-SD在TGF-β誘導(dǎo)下SP細(xì)胞比例的改變以及ABCG2 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:T

5、GF-β可誘導(dǎo)GBC-SD細(xì)胞向間質(zhì)型細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化，間質(zhì)標(biāo)記蛋白VimentinmRNA和蛋白水平表達(dá)上調(diào)，上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin的mRNA和蛋白水平表達(dá)下調(diào)；且發(fā)生EMT后GBC-SD細(xì)胞對吉西他濱、米托蒽醌和表柔比星的IC50值分別增加倍8.1 倍、40 倍和5.7 倍。GBC-SD細(xì)胞在TGF-β處理下，SP細(xì)胞的豐度以及ABCG2 mRNA表達(dá)均明顯增加；撤除TGF-β誘導(dǎo)后，發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化的GBC-SD細(xì)胞逐漸恢復(fù)至

6、上皮細(xì)胞表型。
　　 結(jié)論:TGF-β誘導(dǎo)的可逆性EMT 通過上調(diào)ABCG2 依賴的SP細(xì)胞增加了GBC-SD細(xì)胞的耐藥性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的干性轉(zhuǎn)化。
　　 第三部分
　　 目的:初步闡明Smad3在TGF-β誘導(dǎo)GBC-SD細(xì)胞發(fā)生EMT 上調(diào)SP細(xì)胞豐度過程中的功能。
　　 方法:合成以Smad3基因?yàn)榘悬c(diǎn)的siRNA，并將其轉(zhuǎn)染至經(jīng)TGF-β誘導(dǎo)發(fā)生EMT的GBC-SD細(xì)胞。Western blott

7、ing 檢測Smad3-siRNA 轉(zhuǎn)染前、后發(fā)生EMT的GBC-SD細(xì)胞中Smad3和E-cadherin 蛋白的表達(dá)水平，并通過FACS 檢測SP細(xì)胞亞群的表達(dá)比例。
　　 結(jié)果:在TGF-β的誘導(dǎo)下，GBC-SD細(xì)胞中Smad3 蛋白發(fā)生磷酸化；Smad3-RNAi轉(zhuǎn)染至GBC-SD細(xì)胞后，Smad3 蛋白表達(dá)降低；在TGF-β和siRNA 聯(lián)合作用下，SP細(xì)胞的豐度相對于無RNAi 干擾組下調(diào)，而E-cadherin 蛋