人高分化喉鱗狀細胞癌細胞系FD-LSC-1的建立、鑒定及特征分析.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分:人高分化喉鱗狀細胞癌細胞系FD-LSC-1的建立
　　此部分研究旨在通過采集喉癌標本組織直接進行原代細胞培養(yǎng)來建立一株新的能夠代表近年來中國喉癌喉人群部分發(fā)病機制及生物學特征的喉鱗狀細胞癌細胞系。
　　本研究中，我們嘗試收集了2011年6月-2011年12月在我院確診為喉鱗狀細胞癌的40位患者的喉癌組織標本，其中會厭癌29例，聲門癌8例，頸部轉移淋巴結3例，均為男性患者，

2、年齡46-68歲。將收集的標本組織在24小時之內進行洗滌、消毒、機械剪碎及膠原酶消化后直接進行原代細胞培養(yǎng)或組織塊培養(yǎng)，對生長出的喉癌上皮細胞進行傳代、純化、流式細胞儀及免疫熒光純度測定、定期凍存、支原體污染檢測及復蘇活性測定。同時采集癌旁正常上皮組織進行同法原代培養(yǎng)，作為腫瘤細胞的對照。
　　結果發(fā)現(xiàn):喉癌組織或細胞在體外直接進行原代培養(yǎng)比較困難，細菌及真菌污染和癌細胞不貼壁是培養(yǎng)過程中的主要問題，即使貼壁生長，絕大多數(shù)不超過3

3、代。從40例喉癌標本中我們僅成功建立了一株新的喉鱗狀細胞癌細胞系，命名為FD-LSC-1，來自于一位未經(jīng)治療的分化良好的會厭鱗癌伴雙頸部淋巴結轉移(IVa，T4aN2M0)的68歲男性患者的會厭病灶，該患者沒有喉癌家族史，但有40余年的吸煙史及30余年的飲酒史。FD-LSC-1細胞在體外傳代超過100代，癌細胞已純化，沒有支原體污染，凍存后復蘇的FD-LSC-1細胞活性良好。癌旁正常上皮也成功培養(yǎng)傳代到第8代。
　　以上結果表明:

4、人喉鱗癌FD-LSC-1細胞系已經(jīng)初步建立達永生化;喉鱗癌原代細胞在體外較難成活和培養(yǎng)建系，可能與喉癌病灶大多原發(fā)于有菌腔道且與空氣、消化液或痰液接觸有關;成功建立能夠在體外穩(wěn)定生長和連續(xù)傳代的喉鱗癌細胞系是一項艱苦的工作，需要經(jīng)過多次嘗試和多次失敗才能偶獲成功。
　　第二部分:人高分化喉鱗狀細胞癌細胞系FD-LSC-1的鑒定
　　此部分研究旨在對新建立的喉鱗癌FD-LSC-1細胞系進行進一步鑒定，包括三部分內容:首先是種屬

5、鑒定，確認FD-LSC-1細胞系是人來源的;其次是細胞組織來源鑒定，確認FD-LSC-1細胞系是上皮組織細胞來源的;最后是惡性生物學特征的鑒定，確認FD-LSC-1細胞系是惡性腫瘤。
　　本研究中，首先利用目前最權威的短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat，STR)圖譜技術對FD-LSC-1細胞系的17個短串聯(lián)重復序列基因座及一個性別決定基因座(Amelogenin)進行了檢測分析，通過美國模式培養(yǎng)物集存庫(Ame

6、ricanType Culture Collection，ATCC)對檢測結果進行了種屬鑒定，并與美國ATCC及歐洲微生物和細胞培養(yǎng)物收藏中心(DSMZ，Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)中的遺傳信息進行比對，檢測有無被現(xiàn)存的任何細胞系污染;其次，利用相差顯微鏡觀察FD-LSC-1細胞的形態(tài)，利用免疫熒光法檢測FD-LSC-1細胞廣譜角蛋白及波形蛋白的表

7、達情況，利用透射電鏡技術檢查上皮超微結構;晟后，對FD-LSC-1細胞系進行了惡性生物學特征的鑒定，包括:吉姆薩(Giemsa)染色形態(tài)學觀察、透射電鏡癌細胞超微結構檢查、染色體組核型分析、流式細胞儀DNA倍體分析、軟瓊脂集落形成能力檢測及免疫缺陷小鼠致瘤能力的檢測。
　　結果發(fā)現(xiàn):首先，美國ATCC的檢測報告確認FD-LSC-1細胞系是人來源的細胞系，并且沒有受到美國ATCC及歐洲DSMZ細胞庫中任何細胞系的污染。其次，相差顯微

8、鏡觀察發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細胞呈鵝卵石樣單層貼壁生長，胞漿內?？梢娍张?，與人喉表皮樣癌HEp-2細胞系的多邊形不同;細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細胞為廣譜角蛋白陽性而波形蛋白陰性:透射電鏡檢查發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細胞之間可見橋粒，胞漿內可見張力絲等上皮超微結構。最后，對FD-LSC-1細胞系進行的惡性生物學特征檢測發(fā)現(xiàn):Giemsa染色的FD-LSC-1細胞核分裂像明顯活躍，胞核大，核漿比例增大，可見巨核細胞;透射電鏡癌細胞超微

9、結構檢查發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細胞胞漿內線粒體、核糖體及粗面內質網(wǎng)豐富;染色體組核型分析提示FD-LSC-1細胞系存在明顯的數(shù)量異常和復雜的結構異常，染色體眾數(shù)為68，為近3倍體，結構異常包括染色體增加、缺失及易位等;流式細胞儀DNA倍體及細胞周期分析發(fā)現(xiàn)，與宮頸癌Hela細胞系相比，F(xiàn)D-LSC-1細胞系G0/G1期比例下降，S期比例增高，而G2/M期比例類似;FD-LSC-1細胞系未能夠在半固體軟瓊脂培養(yǎng)基中形成集落;FD-LSC-1

10、細胞能夠順利在免疫缺陷小鼠皮下形成移植瘤，移植瘤HE(hematoxylin&eosin)染色病理提示為高分化鱗癌。
　　以上結果表明:經(jīng)過種屬、組織來源及惡性生物學特征的鑒定，新建立的FD-LSC-1細胞系符合癌細胞系所必需的各項生物學特征，可以確認是人喉上皮組織來源的高分化鱗癌細胞系，且沒有被目前存在的任何細胞系污染。
　　第三部分:人高分化喉鱗狀細胞癌細胞系FD-LSC-1的特征分析
　　此部分研究旨在對已經(jīng)過鑒

11、定的人高分化喉鱗癌FD-LSC-1細胞系進行個性化的特征分析，包括:體外培養(yǎng)群體倍增時間、遷移侵襲潛能、放化療敏感性、Notch1及EGFR(epidermal growth factor receptor)通路、CK(cytokeratin)5及Ki67的蛋白水平、TP53基因突變、人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染、頭頸鱗癌相關分子標記物檢測、頭頸鱗癌相關失調基因檢測及頭頸鱗癌相關失調microR

12、AN檢測，為FD-LSC-1細胞系貼上個性化的特征標簽。本研究中，利用CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒對FD-LSC-1細胞系進行了體外培養(yǎng)的群體倍增時間測定，以Hela細胞系為對照利用包被基質膠的Transwell小室對FD-LSC-1細胞系進行了遷移及侵襲能力的檢測，再以Hela細胞系為對照利用X射線及順鉑對FD-LSC-1細胞系進行了放化療敏感性的檢測，利用Western Blot技術對FD-LSC-1細

13、胞系的Notch1、EGFR、CK5及Ki67的蛋白水平進行了檢測，利用基因測序技術對FD-LSC-1細胞系TP53抑癌基因的全部外顯子進行了突變檢測，利用兩對通用引物結合PCR(polymerase chainreaction)技術對FD-LSC-1細胞系的HPV感染情況進行了檢測，利用免疫組化和免疫熒光技術對FD-LSC-1細胞系的頭頸鱗癌相關重要分子標記進行了檢測，利用SYBR Green實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR，q

14、uantitative real-timepolymerase chain reaction)對FD-LSC-1細胞系的頭頸鱗癌相關失調基因進行了檢測以及利用TaqMan探針qRT-PCR技術對FD-LSC-1細胞系頭頸鱗癌相關失調miRNA進行了檢測。
　　結果發(fā)現(xiàn):FD-LSC-1細胞系在體外培養(yǎng)的群體倍增時間約為24小時，F(xiàn)D-LSC-1細胞系比Hela細胞具有更強的遷移及侵襲潛能但對放化療相對更敏感，F(xiàn)D-LSC-1細胞系

15、具有激活的Notch1和EGFR信號通路以及上調的CK5和Ki67蛋白水平，F(xiàn)D-LSC-1細胞系TP53基因第5和8外顯子分別發(fā)生了錯義突變和無義突變，F(xiàn)D-LSC-1細胞系沒有被HPV感染，F(xiàn)D-LSC-1細胞系表達ADAM10及MLH1等重要的頭頸鱗癌相關分子標記物，SYBR Green qRT-PCR技術發(fā)現(xiàn)了FD-LSC-1細胞系有TERT等14個頭頸鱗癌相關上調基因及KRT4等14個下調基因，TaqMan探針qRT-PCR技