28234.缺糖條件下grp75與p53結(jié)合介導(dǎo)對pc12細胞的保護作用

1、學(xué)校代碼學(xué)號10246072101018缺糖條件下Grp75與p53結(jié)合介導(dǎo)對PCI2細胞的保護作用院系上海醫(yī)學(xué)院專業(yè)遺傳學(xué)碩士研究生郭緯緯導(dǎo)師左僅教授導(dǎo)師組成員楊玲講師劉曉宇講師2010年5月復(fù)口凡學(xué)碩士學(xué)位論文摘要熱休克蛋白家族(heatshockprotein，Hsp)維持著細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和蛋白質(zhì)相互作用的完整，幾乎存在于各種原核生物、真核生物中。在熱休克蛋白的參與下細胞中的各種DNA及蛋白分子依照生物學(xué)規(guī)律嚴格地執(zhí)行著它們的生物

2、學(xué)功能。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75(glucose_re剛atedprotein75，Grp75)是熱休克蛋白家族成員在細胞中行使著分子伴侶功能，參與翻譯后的肽鏈結(jié)合并幫助蛋白質(zhì)正確折疊，參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄參與細胞骨架的穩(wěn)定、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生命活動。越來越多的證據(jù)表明在很多應(yīng)激引起的損傷過程中，Grp75通過多個途徑發(fā)揮其細胞保護功能，包括缺糖損傷。已有的研究發(fā)現(xiàn)，Grp75蛋白通過其253282位氨基酸殘基與p53結(jié)合，這種結(jié)合作用

3、抑制p53核移位。而p53是細胞周期及細胞凋亡過程中的關(guān)鍵分子，那么Grp75對細胞的保護是否經(jīng)由其與p53的結(jié)合抑制其入核，并抑制其表達實現(xiàn)的呢為研究Grp75和p53的結(jié)合是否參與Grp75對細胞的保護過程，構(gòu)建Grp75缺失突變基因的真核表達載體。以SOE—PCR法得到Grp75缺失突變基因，并成功構(gòu)建Grp75缺失突變體特異性表達載體pcDNA3I()／Grp75(A253—282)。為跟蹤研究外源Grp75缺失突變體和p53是

4、如何相互作用的，提取PCI2細胞的RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶得到PCI2細胞的cDNA，以此為模板設(shè)計引物得到表達p53的DNA片段，構(gòu)建其表迭的真核表達戴體pcDNA3l(怫53，用脂質(zhì)體將pcDNA3I()／Grp75(A253282)轉(zhuǎn)染到PCI2細胞株，以lmg／mL濃度的G418篩選出穩(wěn)定株，并命名為PCI2／Grp75(A253282)()。半定量RTPCR和Westernblot結(jié)果顯示PCI2／Grp75(A253282)(十

5、)細胞組內(nèi)Grp75的mRNA和蛋白的表達水平較PCI2細胞組增高結(jié)果顯示Grp75(A253—282)過表達的PCI2細胞株成功構(gòu)建。對PCI2細胞組、PCI2／Grp75(A253—282)()細胞組和PCI2／Grp75()細胞組(pcDNA3／Grp75真核表逃載體已構(gòu)建)分別缺糖oh、3h、9h、18h和36h，M丌法榆測各組細胞活力，Hoechst33324及姬姆薩染色法檢測細胞捌亡情況。結(jié)果顯示Pcl2／G叩75()組細胞

6、活力均高于其它兩組，PCI2／Grp75(Zk253282)()組高于PCI2紐，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Hoechst33324及姬姆薩染色后，存活細胞的比率與MTT細胞活力檢測結(jié)果基本一致。以上結(jié)果表明Grp75基因253282位點的缺失在一定程度上降低了其對細胞的保護作用。Westemblot檢測三種細胞內(nèi)p53的表達量，PCI2／Grp75(A253—282)()細胞內(nèi)p53蛋白表達量高于Grp75過表達組，與PCI2細胞組基本一致。