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文檔簡介
1、白菜(包括結球白菜和不結球白菜)在亞洲特別是中國、日本和韓國是最重要的蔬菜。白菜的生產過程易受蟲害侵擾,且需水量大。通過基因工程導入外源基因,可以創(chuàng)造出白菜的新種質,進而從根本上改變白菜種質資源。
農桿菌介導的浸花(floral-dip)轉化方法是近年發(fā)展起來的一種較簡便的不依賴組織培養(yǎng)的轉基因方法。該方法的優(yōu)點在于可以避開組織培養(yǎng)和繼代培養(yǎng),直接獲得轉基因的種子,而且相對于真空轉化,對儀器設備要求較低。因此,該轉化方法適用于
2、難以進行組織培養(yǎng)和離體再生的植物。本研究以攜帶 pBBB-intron-gus質粒的農桿菌C58為轉化用工程菌,對5個結球白菜品系(08-1083-2,08-1084-2,02-311,02-507,06-940)和不結球白菜四九菜心進行農桿菌介導的浸花轉化,以期為探索功能基因導入白菜活體的方法提供一定的理論根據(jù)。其中大白菜品系08-1083-2收獲了14棵抗性株,經鑒定后證明沒有獲得轉化株,不結球白菜四九菜心獲得4棵抗性株,GUS檢測
3、為非真實轉化株。
為了進一步探討農桿菌通過浸花處理難以進入白菜花器官的可能原因,對擬南芥和四九菜心兩種材料不同發(fā)育階段的花蕾進行形態(tài)及解剖觀察,以研究二者在花發(fā)育節(jié)律及形態(tài)結構上的差異。結果顯示,兩種材料均是幼嫩子房時成開口杯狀,隨著花蕾長大,心皮逐漸閉合;調查新生花蕾在花序總花蕾中所占的比例,四九菜心為20%,而擬南芥高達62.6%;綜合形態(tài)及解剖觀察結果,可以推斷花蕾期心皮閉合至開花的時間,四九菜心約為15天,而擬南芥僅需
4、3天。有研究指出,開放的心皮形成的孔道可能是是農桿菌進入供試材料體內的途徑之一,而浸花法轉化發(fā)生的部位大多在未成熟花蕾中。由此可以推斷,過早閉合的心皮可能是造成農桿菌不能順利進入四九菜心的原因之一,而新生花蕾占總花蕾比例較低造成四九菜心轉化率的降低。
為了證實這一推測,本研究對不結球白菜引心360和擬南芥進行了平行浸花實驗,分析供試材料花器官中農桿菌數(shù)量的差異,試圖闡釋白菜轉化率低的原因。首先以含0.225g/L ppt除草劑
5、 Basta的溶液噴施處理株收獲的種子,對照材料獲得了抗性株(3株),其植株轉化率為20%,而引心360沒有獲得抗性株。GUS檢測證明擬南芥抗性株中外源基因得以表達。然后采用細菌平板培養(yǎng)法,研究處理材料花蕾內農桿菌的數(shù)量差異。結果表明,在浸花處理后的6天內,在添加擬南芥花蕾提取物的篩選平板上,仍能培養(yǎng)出60-900的菌落數(shù)(s/g),而在加白菜花蕾提取液的平板上,菌落形成單位為0。這說明農桿菌很難通過浸花處理進入白菜花器官內,在一定程度
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