IBDV VP1單克隆抗體的制備和穩(wěn)定表達(dá)Vero E6細(xì)胞系的建立.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一，其病毒(Infeetious bursal disease virus，IBDV)主要侵害雛雞的中樞免疫器官法氏囊，導(dǎo)致免疫抑制。VP1是一種依賴RNA的RNA聚合酶，與IBDV的復(fù)制效率和毒力的關(guān)系日趨成為研究IBDV的熱點(diǎn)。筆者現(xiàn)有資料，國(guó)內(nèi)關(guān)于IBDV VP1的表達(dá)、單克隆抗體的制備和穩(wěn)定表達(dá)’VP1細(xì)胞系的建立尚未見(jiàn)報(bào)道

2、。 本研究的目的之一是構(gòu)建IBDV VP1基因的原核表達(dá)載體，以原核表達(dá)的VP1蛋白為免疫原制備特異性單克隆抗體，制備的單克隆抗體可以為下一步建立細(xì)胞系提供檢測(cè)的物質(zhì)條件；目的之二構(gòu)建IBDV VP1基因的真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)定表達(dá)VP1蛋白的Vero E6細(xì)胞系，為深入研究VP1與病毒復(fù)制和毒力的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 本課題主要研究?jī)?nèi)容包括以下幾方面： 1．IBDV VP1的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備從已構(gòu)建含有I

3、BDV Gt株B節(jié)段的質(zhì)粒中擴(kuò)增出VP1基因，將其克隆到表達(dá)載體pET32a。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E．coli DH5α，獲得重組陽(yáng)性質(zhì)粒pET32α-VP1。將pET32α-VP1轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)下成功表達(dá)了約115 ku的VP1融合蛋白，并以包涵體形式存在。用電泳法純化蛋白并免疫：BALB/c小鼠，制備了多克隆抗體。Western blot分析表明，純化的蛋白能夠被抗His單克隆抗體和IBDV陽(yáng)性血清識(shí)別。EL

4、ISA分析表明，制備的融合蛋白抗血清效價(jià)在1：12800以上。間接免疫試驗(yàn)表明，多克隆抗體能與自然結(jié)構(gòu)的IBDV發(fā)生特異性反應(yīng)。 2．IBDV VP1單克隆抗體的制備與鑒定取上面免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞常規(guī)融合，依次進(jìn)行HAT選擇培養(yǎng)，間接ELISA法篩選陽(yáng)性克隆，有限稀釋法進(jìn)行單克隆化。獲得了C4、D4兩株能穩(wěn)定分泌抗IBDVVP1的雜交瘤細(xì)胞株，并對(duì)C4、D4進(jìn)行了穩(wěn)定性、特異性方面的鑒定。腹水的效價(jià)分別為1×

5、10<'5>和1×10<'2>，IgG亞類鑒定均為。IgGl。 3．穩(wěn)定表達(dá)IBDV VP1的Vero E6細(xì)胞系的建立將IBDV Gt株的VPl基因分別克隆到真核表達(dá)載體pCI-neo和pEGFP-N1，獲得真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-neo/VP1和pEGFP-N1/VP1。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，將其導(dǎo)入Vero E6細(xì)胞，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析。經(jīng)G418篩選后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，用有限稀釋法獲取亞克隆細(xì)胞株。然后通過(guò)間接免疫熒光和RT-PC