免疫毒理

1、免疫毒理學(xué),免疫毒理學(xué)（immunotoxicology）是研究外源化學(xué)物和物理因素等對機體免疫系統(tǒng)的損害作用、生物學(xué)機制及其危險度評價與管理，在免疫學(xué)和毒理學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門毒理學(xué)分支學(xué)科。,定義的提出 1984年，國際化學(xué)品安全規(guī)劃署（IPCS）和歐共體委員會（CEC）共同組織了“免疫系統(tǒng)是毒物損傷的靶”的研討會，會議對免疫毒理學(xué)進行了上述定義，并達成共識。會議提出了免疫毒性評價必不可少的兩個步

2、驟： ※ 藥物和化學(xué)物對免疫系統(tǒng)毒性的鑒定 ※ 免疫毒性的危險度評價,各種免疫器官和組織、免疫細胞及免疫分子共同構(gòu)成了復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，這是機體免疫功能正常發(fā)揮的物質(zhì)基礎(chǔ),第一節(jié) 免疫生物學(xué)基礎(chǔ)概述,一、免疫系統(tǒng)的組成及其功能,粘膜相關(guān)淋巴組織,完整的免疫系統(tǒng)由免疫器官和組織、免疫細胞及免疫分子所組成。,免疫系統(tǒng)可以識別自身和非己抗原，對自身耐受，且清除非己，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，表現(xiàn)為免疫防御、免疫自穩(wěn)

3、和免疫監(jiān)視三大功能。,（一）免疫器官和組織,,,骨髓：B淋巴細胞發(fā)育成熟的場所。胸腺：由胸腺基質(zhì)細胞和胸腺細胞組成。是T淋巴細胞尤其是αβ+T細胞發(fā)育的場所。胸腺基質(zhì)細胞與胸腺細胞的相互作用，對T細胞的發(fā)育是至關(guān)重要的。,脾臟 T：35%、B：55%Mφ：10%,淋巴結(jié) T：75%、B：25%,,粘膜相關(guān)淋巴組織 在呼吸道、腸道及泌尿生殖道的黏膜上皮細胞下，均聚集有無包膜的淋巴組織。在小腸黏膜上皮細胞間存

4、在一類T細胞稱上皮淋巴細胞。即： αβ+T細胞——特異免疫應(yīng)答； γδ+T細胞——固有免疫應(yīng)答,（二）免疫細胞,免疫細胞（immunocyte）廣義地指對抗原物質(zhì)產(chǎn)生特異性和非特異性免疫應(yīng)答的各種細胞。大體上分為免疫活性細胞、輔佐細胞和其它細胞三類。,1．免疫活性細胞（immunoconpetent cell, ICC）,指能識別特異性抗原以及受抗原刺激后向母細胞轉(zhuǎn)化、分裂增殖并分化為能產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)（如抗體、淋巴因子）

5、的淋巴細胞群，包括T淋巴細胞和B淋巴細胞。,,淋巴細胞（Lymphocyte）,分B細胞和T細胞，分別來源于骨髓和胸腺。在機體免疫應(yīng)答中起核心作用。B淋巴細胞：表面的BCR及分泌的抗體均為免疫球蛋白。由B細胞介導(dǎo)的免疫稱為體液免疫。T淋巴細胞：TCR為雙鏈分子。細胞毒性T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞（輔助性T細胞和抑制性T細胞）,,,人類T細胞亞群及其功能,B 淋 巴 細 胞,始祖B細胞,前B細胞,不成熟B細胞,成熟B細胞,來于骨髓淋巴樣干細

6、胞，無smIg表達， CD19+,無smIg表達，但胞漿中出現(xiàn)?鏈，同時有MHC-II表達，CD19+、20+,膜表面出現(xiàn)單體IgM，開始表達CD21，CD19、20、MHC-II類分子表達量增多,表達smIgM、 smIgD、IgGFc-R、C3bR、絲裂原受體及CD19、20、21等,無免疫應(yīng)答功能,smIgM同自身抗原結(jié)合可產(chǎn)生抑制信號，導(dǎo)致自身反應(yīng)性B細胞處于無功能抑制狀態(tài)，產(chǎn)生自身耐受,具有接受抗原的刺激并發(fā)生增殖分化的能力，

7、是抗體產(chǎn)生的源泉細胞；其中部分可成為記憶性B細胞,,,,,,,,,,,,主要抗原呈遞細胞的比較,,APC,主要特征,分布,簡稱,,C3bR,Fc?R,MHC分子,吞噬,,B細胞,朗罕氏細胞,并指狀細胞,樹突狀細胞,巨噬細胞,BC,LC,IDC,DC,M?,外周血、淋巴結(jié)、脾,表皮組織某些上皮層,淋巴組織、胸腺依賴區(qū),淋巴濾泡,全身細胞和組織,+,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,,2．輔佐細胞（

8、accessory cell，A細胞）,在免疫應(yīng)答中呈遞抗原，又稱抗原呈遞細胞（antigen presenting cell；APC），主要有樹突細胞（DC）、單核細胞和巨噬細胞。B細胞是抗原特異性呈遞細胞。,掃描電鏡顯示：在感染早期，M?伸出長長的偽足去捕獲細菌,M?吞噬處理入侵細菌及提呈抗原的機制,來源：骨髓。 分布：外周血和淋巴組織。 標志：CD16、CD56。 特征：胞漿中含豐富的嗜天青顆粒，又稱大顆粒細胞。

9、 功能：非特異性殺傷某些腫瘤細胞和病毒感染細胞，在早期抗病毒感染、清除突變細胞的免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用。其殺傷作用無需抗原致敏，不受MHC限制。,3．其他免疫細胞,NK細胞,LAK細胞,在IL-2的作用下，體外培養(yǎng)的淋巴細胞才能發(fā)揮強烈的殺傷功能，也叫淋巴因子激活的殺傷細胞。能殺傷Tc、NK不敏感的腫瘤細胞,單 核 吞 噬 細 胞,包括骨髓中的前單核細胞、外周血中的單核細胞和組織內(nèi)的巨噬細胞，具有重要的抗感染、抗腫瘤和免

10、疫調(diào)節(jié)的作用。（一）表面標志：表面抗原：高表達MHC-I/II類分子表面受體：IgG Fc受體，包括高親和力的FcεRI、中親和力的FcεRII和低親和力的FcεRIII。作用：參與調(diào)理和ADCC。補體受體（CRI），為C3b受體，與吞噬和免疫黏附作用有關(guān)。,單核吞噬細胞生物學(xué)功能,1、吞噬殺傷作用：直接吞噬、調(diào)理吞噬作用2、抗原提呈作用：即外來的抗原性異物通過巨噬細胞的捕獲、加工和處理后，與胞內(nèi)合成的MHC-1/II類分

11、子形成抗原肽－MHC分子復(fù)合物，并被呈遞到細胞膜表面，被TCR識別的作用。具有此作用的細胞叫抗原呈遞細胞（antigen presenting cell,APC）。 巨噬細胞表面還表達多種共刺激分子，如B7、ICAM-1、LFA-1,3等分別與T細胞上的CD28、LFA-1(CD11)、LFA-2(CD2)等相互作用，為T細胞的活化提供第二信號。3、抗腫瘤作用：Mφ被某些細胞因子如IFN-γ激活后能有效殺傷腫瘤等靶細胞，其

12、吞噬殺菌能力也顯著提高。4、分泌生物活性介質(zhì)，產(chǎn)生免疫應(yīng)答和其它免疫效應(yīng)：如IL-1,12、IFN、TNF、PGE等;以及某些補體成份和凝血因子、組織修復(fù)因子等。,（三）免疫分子,免疫球蛋白（immunoglobulin；Ig）補體（complement；C‘）細胞因子（cytokine；CK）HLA分子,二、免疫應(yīng)答過程及其病理反應(yīng),免疫應(yīng)答（immune response）是機體非特異性和特異性的識別并排除異己成分以維持自身

13、穩(wěn)定的全過程，因而免疫應(yīng)答是整個免疫學(xué)的核心。非特異性免疫應(yīng)答指吞噬作用和炎癥反應(yīng)，特異性免疫應(yīng)答是指細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答?？乖碳／B細胞產(chǎn)生致敏T細胞和／或抗體稱正應(yīng)答，未產(chǎn)生致敏T細胞或抗體的為負應(yīng)答即耐受，抗原還可誘導(dǎo)T／B細胞凋亡。免疫應(yīng)答維護了內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，因而是保護性的，但不適當(dāng)?shù)膽?yīng)答也會導(dǎo)致病理性損傷。,（一）免疫應(yīng)答的三個階段,1.啟動階段 指T細胞或B細胞對APC呈遞的抗原識別階段。主要包括抗

14、原呈遞、T細胞對抗原和MHC的識別、B細胞雙識別、T細胞活化的雙信號和B細胞活化的雙信號等重要環(huán)節(jié)。2.誘導(dǎo)階段（1）T細胞活化、增殖和分化 （2）B細胞活化、增殖和分化 3.效應(yīng)階段（1）T細胞介導(dǎo)的細胞免疫效應(yīng) （2）抗體介導(dǎo)的免疫效應(yīng),（二）免疫應(yīng)答的病理反應(yīng),異常的免疫反應(yīng)主要包括免疫抑制與免疫增強兩種情況。免疫增強是指機體過度的或不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)狀態(tài)。過度的或不適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答可導(dǎo)致機體各種病理損害，有關(guān)的疾病主要

15、有超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病等。,1.超敏反應(yīng),指機體再次接觸同一抗原時所發(fā)生的不同形式的免疫病理損害過程。超敏反應(yīng)的發(fā)生往往取決于外來物質(zhì)作為抗原的特異性和機體反應(yīng)的特性兩大因素。,超敏反應(yīng)的類型,Comparison of hypersensitivity reactions,,,,,I型超敏反應(yīng)的基本過程,,,,,,,,,Type IV hypersensitivity the three forms,,2.自身免疫反應(yīng),自身免疫反

16、應(yīng)是指機體免疫系統(tǒng)對自身抗原發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生自身抗體或/和自身致敏淋巴細胞，引起機體病理損害甚至導(dǎo)致疾病的過程。器官特異性自身免疫性疾病 器官非特異性自身免疫性疾病又叫全身性或系統(tǒng)性自身免疫性疾病,第二節(jié) 免疫毒性作用及其機制,外源化學(xué)物和物理因素可以直接損傷免疫器官和組織、免疫細胞的結(jié)構(gòu)和功能，影響免疫分子的合成、釋放和生物活性，或通過干擾神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)等間接作用，使免疫系統(tǒng)對抗原產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)膽?yīng)答，即過高或過低的應(yīng)答，或?qū)ψ陨砜?/p>

17、原的應(yīng)答，都會導(dǎo)致免疫病理過程，發(fā)展為免疫性疾病。應(yīng)答過低可引起免疫抑制(immunosuppression)，使宿主對病原體或腫瘤的易感性增加，嚴重時表現(xiàn)為免疫缺陷；應(yīng)答過高則表現(xiàn)為超敏反應(yīng)（hypersensitivity）；自身抗原應(yīng)答細胞被激活則引起自身免疫(autoimmunity)外源化學(xué)物對免疫系統(tǒng)的影響常常是復(fù)雜的。,一、免疫抑制,免疫抑制的結(jié)果是機體抵抗力降低，主要表現(xiàn)為抗感染能力降低和腫瘤易感性增加。

18、 具免疫抑制作用的外源化學(xué)物種類繁多 外源化學(xué)物引起免疫抑制的機制較為復(fù)雜，僅就其作用方式而言，通常分為直接作用和間接作用兩大類。,外源化學(xué)物對神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)某一環(huán)節(jié)的損害，都可能影響正常的免疫功能。 外源化學(xué)物免疫損傷的分子機制: 轉(zhuǎn)錄核因子（NF-κB）或活化的T細胞核因子（NF-AT）是免疫應(yīng)答過程中重要的免疫調(diào)節(jié)因子。 外源化學(xué)物還可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)、破壞細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、抑制cA

19、MP等機制影響淋巴細胞的正常功能，引起免疫抑制,二、超敏反應(yīng),外源化學(xué)物引起的超敏反應(yīng)同樣涉及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型反應(yīng)類型。能引起超敏反應(yīng)的外源化學(xué)物或混合物有數(shù)百種，可來自食物、藥物，也可以從職業(yè)或生活環(huán)境中接觸?；瘜W(xué)物引起超敏反應(yīng)機制 外源性化學(xué)物本身作為抗原或半抗原引發(fā)超敏反應(yīng) 改變抗體免疫應(yīng)答的敏感性或強度而導(dǎo)致超敏反應(yīng),三、自身免疫,很多能誘發(fā)Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型超敏反應(yīng)的外源化學(xué)物都可以引起自身免疫，尤以藥物多見

20、。 外源化學(xué)物引起自身免疫的機制 （1）引發(fā)機體針對自身抗原產(chǎn)生自身抗體進行免疫應(yīng)答 （2）引發(fā)機體產(chǎn)生針對自身抗原的自身應(yīng)答性T細胞進行免疫應(yīng)答 （3）造成自身隱蔽抗原的暴露或釋放、改變自身抗原或形成新的自身抗原，從而引起自身免疫。 （4）改變血細胞或其他組織細胞的抗原性，這種改變了的抗原刺激機體產(chǎn)生自身抗體。 （5）影響正常免疫調(diào)節(jié)功能，如激活對自身抗原處于耐受態(tài)的T細胞，或通過APC表面輔助刺激因子異常表達，或引起Th

21、1和Th2功能失衡，引起自身免疫,免疫缺陷（immunodeficiency, ID），是指因先天性或繼發(fā)性免疫系統(tǒng)功能不全的疾病。這主要源于抗體缺陷、細胞免疫缺陷、巨噬細胞缺陷或補體系統(tǒng)缺陷。發(fā)生免疫缺陷的主要原因是先天性免疫系統(tǒng)遺傳基因異常 能引起免疫抑制作用的外源化學(xué)物多數(shù)可能導(dǎo)致機體免疫缺陷的發(fā)生。影響其發(fā)生的主要因素是化學(xué)毒物作用的劑量、持續(xù)時間和機體免疫應(yīng)答狀況等。妊娠期或圍生期接觸外源化學(xué)物會嚴重影響胎兒出生后T細胞、

22、B細胞、吞噬細胞的發(fā)育、遷移、歸巢及其功能，可能暫時或永久性地損傷機體的免疫系統(tǒng)。,第三節(jié) 免疫毒性作用的試驗方法與評價,一、檢測方案,（一）美國NTP推薦的嚙齒類動物（多用雌性小鼠）免疫毒性檢測方案（二）WHO推薦的人群免疫毒性檢測方案（三）美國FDA/ CDER的新藥免疫毒理學(xué)評價規(guī)范,美國NTP推薦的小鼠免疫毒性檢測方案（USNTP,1988）,WHO推薦的人群免疫毒性檢測方案（WHO，1992）,美國FDA/ CDER的新藥

23、免疫毒理學(xué)評價規(guī)范(2019),提出要考慮藥物對免疫系統(tǒng)五個方面的影響，除了免疫抑制、超敏反應(yīng)和自身免疫外，還有免疫原性（immunogenecity）和不良免疫刺激（adverse immunostimulation）。前者指藥物及其代謝產(chǎn)物引起免疫反應(yīng)的能力，后者指藥物對免疫系統(tǒng)某些成分的任何抗原非特異性的、不適當(dāng)?shù)幕螂y以控制的活化作用，并指出可根據(jù)不同藥物的特點和具體情況靈活選擇合適的參數(shù)項目和評價。,二、檢測方法,（一）免疫病理

24、學(xué)檢查 觀察免疫器官的大?。ㄖ亓浚┖痛篌w形態(tài)，然后進行組織病理學(xué)檢查 主要觀察胸腺、脾臟、淋巴結(jié)和骨髓的組織結(jié)構(gòu)和細胞類型，同時要注意檢查局部粘膜相關(guān)淋巴組織一般先用常規(guī)染色法染色，根據(jù)需要再選擇免疫組化等特異性方法利用熒光標記單克隆抗體和流式細胞儀觀察淋巴細胞表面標記是目前檢查淋巴細胞表型的可靠方法，而以往多采用直接或間接免疫熒光法,（二）免疫功能檢測,固有性免疫應(yīng)答評價 1．NK細胞活性測定 觀察

25、NK細胞對敏感的腫瘤細胞的溶解作用 LDH釋放法 2．巨噬細胞功能檢測 同位素鉻標記雞紅細胞（51Cr-cRBCs）吞噬法 炭粒廓清試驗、巨噬細胞溶酶體酶測定、巨噬細胞促凝血活性測定、巨噬細胞表面受體檢測,適應(yīng)性或獲得性免疫應(yīng)答評價3．體液免疫功能檢測 用特異性抗原免疫動物，刺激脾B細胞活化并分泌抗體，然后觀察抗體生成量或抗體形成細胞數(shù) 前者可用ELISA、免疫電泳法、血凝法等直接測定血清抗體

26、濃度，后者常用空斑形成細胞（PFC）試驗 4．細胞免疫功能檢測 細胞毒性T細胞殺傷試驗（CTL） T淋巴細胞增殖試驗 遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DHR） 宿主抵抗力試驗,（三）免疫細胞因子的檢測,各種細胞因子（受體）檢測方法的比較,（四）超敏反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)檢測,Ⅰ型超敏反應(yīng)被動皮膚過敏試驗（PCA）主動皮膚過敏試驗（ACA）主動全身過敏試驗（ASA） Ⅳ型超敏反應(yīng) Buecher試驗（BA）豚鼠

27、最大值試驗（GPMT）豚鼠遲發(fā)性皮膚超敏反應(yīng)（DHR） 目前還沒預(yù)測Ⅱ型和Ⅲ型超敏反應(yīng)的標準試驗方法。,（五）其他檢測方法的應(yīng)用,分子生物學(xué)技術(shù)與方法轉(zhuǎn)基因/基因敲除動物模型重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠模型計算毒理學(xué)方法的應(yīng)用,重癥免疫聯(lián)合缺陷小鼠（SCID mice）是一種近交系CB-17的自發(fā)突變體。小鼠T、B細胞均缺失，不產(chǎn)生免疫應(yīng)答和腫瘤排斥反應(yīng)，因而是接受外源移植物的極好宿主。用人的免疫細胞移植這些小鼠，從而使這些小鼠在一定