應(yīng)用RNAi阻斷AhR介導(dǎo)的TCDD免疫毒理作用的初步研究.pdf

1、2,3,7,8-四氯二苯-對(duì)-二噁英(2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)是環(huán)境污染物多氯聯(lián)苯類化合物中毒性最強(qiáng)的一種。研究發(fā)現(xiàn)，TCDD有強(qiáng)烈的致癌、致畸、致病的毒性作用，對(duì)人體的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，并危害肝臟、眼睛、皮膚等多種器官的功能。因此研究其作用機(jī)制具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。 免疫系統(tǒng)是對(duì)TCDD最敏感的靶系統(tǒng)之一，TCDD對(duì)機(jī)體的細(xì)

2、胞免疫、體液免疫和抵抗力都有顯著的抑制效應(yīng)。而隱藏在這一系列功能改變下面的分子水平機(jī)制研究也逐漸得到深入。TCDD的芳香烴受體(arylhydrocarbonreceptor，AhR)介導(dǎo)途徑、TCDD對(duì)多種激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的干預(yù)、對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+代謝、自由基代謝的影響、TCDD與激素受體的相互作用是近年來(lái)研究的幾個(gè)主要方向。其中，以TCDD的AhR介導(dǎo)途徑得到最多的關(guān)注。 AhR被認(rèn)為是TCDD在細(xì)胞內(nèi)的重要受體，在TCDD免

3、疫毒性介導(dǎo)途徑中起到重要作用，其可能機(jī)制是，AhR與TCDD結(jié)合后被激活，隨即進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合AhR核轉(zhuǎn)位因子，然后通過(guò)識(shí)別并結(jié)合效應(yīng)基因的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等基因調(diào)控元件，增強(qiáng)或抑制效應(yīng)基因的表達(dá)，從而直接或間接影響淋巴細(xì)胞的功能。 我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)：①TCDD對(duì)B淋巴細(xì)胞的功能存在顯著的抑制效應(yīng)；②B淋巴細(xì)胞存在AhR；③AhR是TCDD抑制B淋巴細(xì)胞功能的重要介導(dǎo)途徑；④可能有非AhR依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑存在。同時(shí)也有其他實(shí)驗(yàn)

4、室研究資料表明，AhR并非是TCDD毒理效應(yīng)的唯一介導(dǎo)途徑。 綜合以上研究資料可以看出，如采用一定研究手段抑制TCDD毒理作用中AhR基因的表達(dá)，可具有以下兩方面的意義，1)觀察抑制AhR表達(dá)是否阻斷TCDD免疫毒性作用，為T(mén)CDD中毒癥狀的治療提供靶點(diǎn)及理論依據(jù)；2)觀察AhR表達(dá)的下降程度與TCDD免疫毒性的減弱程度之間的關(guān)系，明確AhR在TCDD免疫毒性作用介導(dǎo)過(guò)程中的地位，進(jìn)一步揭示TCDD的毒性作用機(jī)制。 近年

5、在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域引起廣泛重視的RNA干擾(RNAinterference，RNAi)屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制中的一類。該現(xiàn)象的主要原理是，小分子干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)能夠在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合包括RNA酶在內(nèi)的多種配基形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，該復(fù)合體能特異地識(shí)別并降解與siRNA同源的mRNA序列，從而達(dá)到基因沉默的目的。 RNAi已被開(kāi)發(fā)為一項(xiàng)特異性抑制基因表達(dá)的得力工具，并隨著hH1、h

6、U6、mU6等具有siRNA特異性的啟動(dòng)子被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，對(duì)siRNA表達(dá)的人為調(diào)控成為可能，也使RNAi技術(shù)具備了長(zhǎng)效沉默基因表達(dá)的能力。尤其是與轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合以后，RNAi技術(shù)具有了巨大的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。 研究表明，TCDD在人體或動(dòng)物體內(nèi)的滯留時(shí)間很長(zhǎng)，其毒性作用也一直持續(xù)存在。Baccarelli等對(duì)20年前意外事故中暴露于TCDD的人群進(jìn)行跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，暴露者血液中仍可檢測(cè)出高含量的TCDD，并且其濃度與血漿中免疫球蛋白

7、和補(bǔ)體水平的降低成正比。有鑒于此，構(gòu)建有效表達(dá)AhRsiRNA的病毒或相關(guān)載體，并研究其對(duì)TCDD免疫毒性效應(yīng)的阻斷能力，將為T(mén)CDD隉性中毒的基因治療提供手段和理論基礎(chǔ)。 基于以上幾個(gè)方面的認(rèn)識(shí)，本研究擬在已有的工作基礎(chǔ)上，達(dá)成三個(gè)目標(biāo)：①采用暫時(shí)性RNAi技術(shù)抑制CH12.LX細(xì)胞中AhR基因的表達(dá)，觀察AhR基因表達(dá)的沉默是否阻斷了TCDD的免疫毒性作用，以進(jìn)一步明確AhR在TCDD效應(yīng)機(jī)制中的地位，及為T(mén)CDD中毒的治療

8、提供靶點(diǎn)及理論依據(jù)；②篩選出能進(jìn)入B淋巴細(xì)胞株的載體，為長(zhǎng)效RNAi研究奠定基礎(chǔ)，并為T(mén)CDD慢性中毒的基因治療提供理論依據(jù)和有效手段；③對(duì)RNAi技術(shù)在應(yīng)用方面的不足之處進(jìn)行探索和完善。 本研究的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論：1.TCDD對(duì)CH12.LX細(xì)胞的免疫毒性效應(yīng).2.AhR基因表達(dá)的暫時(shí)性抑制及其對(duì)TCDD免疫毒性的阻斷效應(yīng). 3.AhR基因表達(dá)長(zhǎng)效性抑制的初步探索前期研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑對(duì)CH12.LX細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率極低，因