粗糙型豬霍亂沙門菌與鼠傷寒沙門菌rfaJ基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、食品安全是一重要的社會民生問題，豬肉是人類主要的動物食品，但豬及其制品易受沙門菌感染，威脅著食品安全及人類健康。豬霍亂沙門菌為宿主適應(yīng)性沙門菌，易引起2-4月齡仔豬副傷寒病，發(fā)病死亡率較高，對養(yǎng)豬業(yè)中有著嚴(yán)重的危害。同時，鼠傷寒沙門菌作為沙門菌最常見血清型，其動物宿主廣泛，包括豬，是重要的食源性病原菌之一，也是人類食物中毒主要原因。實踐證明，疫苗是防控豬沙門菌病的有效措施之一。
　　豬霍亂沙門菌C500株已經(jīng)作為減毒疫苗使用40余

2、年，該疫苗可從動物飼養(yǎng)源頭控制沙門菌對動物的感染和侵害，能有效預(yù)防仔豬副傷寒，并減少沙門菌對肉產(chǎn)品的污染，從而減少沙門菌通過食物鏈感染人類，阻斷沙門菌人畜之間傳播，防止沙門菌病的發(fā)生。該疫苗在疾病防控中發(fā)揮重大作用，但遺憾的是動物接種該疫苗后不能通過基于玻板凝集的試驗方法，簡單快速鑒別動物是被免疫還是被感染(Differentiating Infected from VaccinatedAnimals，DIVA)。為此，本研究構(gòu)建豬霍亂

3、沙門菌的LPS相關(guān)基因rfaJ缺失株，致力于區(qū)分免疫動物和自然感染動物。另外，還構(gòu)建了鼠傷寒沙門菌D6的faJ缺失株，并對它們生物學(xué)特性和免疫保護進行了評價，初步探索了rfaJ基因在DIVA疫苗設(shè)計及其鑒別診斷中的應(yīng)用潛能。
　　1.豬霍亂沙門菌rfaJ基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究
　　本研究利用λ-red同源重組方法構(gòu)建了豬霍亂沙門菌C500ΔrfaJ缺失株，測序和PCR鑒定結(jié)果表明，rfaJ基因從基因組中缺失，同時

4、構(gòu)建了回復(fù)株C500Δrfa∷rfaJ。缺失株C500ΔrfaJ的生長速度與野生株C500相比無明顯變化，液體培養(yǎng)缺失株C500ΔrfaJ易發(fā)生自凝集沉淀現(xiàn)象。與親本株C500相比，缺失株LPS結(jié)構(gòu)因O抗原缺失而不再完整，細(xì)菌由光滑型變?yōu)榇植谛汀500ΔrfaJ免疫后的小鼠血清不與親本株C500發(fā)生凝集，能夠區(qū)分感染動物和免疫動物的血清。缺失株C500ΔrfaJ感染豬空腸上皮細(xì)胞IPEC-J2后，缺失株C500ΔrfaJ對細(xì)胞的黏附和

5、侵染能力有明顯下降(P＜0.01），其在細(xì)胞內(nèi)增殖能力無顯著變化。熒光定量PCR方法檢測C500ΔrfaJ刺激細(xì)胞后細(xì)胞炎性因子mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與親本株C500感染細(xì)胞組相比，TNF-α、IL-4與IL-6表達(dá)水平明顯下降。
　　2.鼠傷寒沙門菌rfJ基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究
　　以鼠傷寒沙門菌D6為研究對象，構(gòu)建了D6ΔrfaJ基因缺失株及其回復(fù)株D6ΔrfaJ∷rfaJ。鼠傷寒沙門菌D6ΔrfaJ基

6、因缺失株生物特性與豬霍亂沙門菌缺失株C500ΔrfaJ的生物特性基本一致。缺失株D6ΔrfaJ生長速度與野生株相比無明顯變化，液體培養(yǎng)過程中缺失株發(fā)生自凝集沉淀;與其親本株D6相比較，D6ΔrfaJ的LPS結(jié)構(gòu)因O抗原缺失不再完整，細(xì)菌由光滑型變?yōu)榇植谛停珼6ΔrfaJ免疫后的小鼠血清不與其親本株D6發(fā)生凝集。然而，有些生物學(xué)特性發(fā)生了改變，多項生化指標(biāo)發(fā)生改變，缺失株運動能力下降。以缺失株D6ΔrfaJ和親本株D6分別感染豬空腸上皮細(xì)

7、胞IPEC-J2后發(fā)現(xiàn)，缺失株D6ΔrfaJ對細(xì)胞的黏附和侵染能力有明顯下降，但增殖能力無特別明顯變化，并在感染8h后缺失株的增殖能力超過親本株D6;以BALB/c為動物模型，口服途徑免疫6周齡小鼠，間隔2周，再次免疫，2周后以口服途徑攻毒，對D6ΔrfaJ進行了免疫保護效力評價，結(jié)果顯示，血清中抗體水平在14d時達(dá)到較高水平，并且小鼠經(jīng)2次免疫后兩周，能夠?qū)Ω叨玖闟L1344提供80％的免疫保護;缺失株D6ΔrfaJ在體內(nèi)臟器和糞