半胱氨酸雙加氧酶及其模型化合物催化反應(yīng)機(jī)理和活性調(diào)控機(jī)制的理論研究.pdf

1、單核非血紅素鐵酶是一類(lèi)重要的金屬蛋白酶，它參與許多重要的需氧的生化反應(yīng)。在自然界中，好氧生物需要利用氧氣為其生命過(guò)程提供能量并完成各種新陳代謝過(guò)程。但是，大氣中氧分子的基態(tài)為三重態(tài)，而被氧化的有機(jī)底物的基態(tài)一般為單重態(tài)，這是一個(gè)自旋禁阻的反應(yīng)過(guò)程。一方面，這意味著所有的有機(jī)物自發(fā)燃燒為二氧化碳和水是一個(gè)禁阻的過(guò)程；而另一方面，自旋禁阻也導(dǎo)致三重態(tài)的氧氣參加的反應(yīng)是一個(gè)相當(dāng)緩慢的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。在這種情況下，含有過(guò)渡金屬的氧活化酶被用來(lái)解決這

2、一問(wèn)題。這些金屬蛋白酶可以高選擇性地催化和控制生物體內(nèi)各種有機(jī)物的氧化過(guò)程，并且它們活性中心的結(jié)構(gòu)可以隨著催化功能的不同而發(fā)生變化。理解這些酶的催化反應(yīng)機(jī)理和氧氣激活的活性調(diào)控機(jī)制是當(dāng)前國(guó)際學(xué)術(shù)研究的熱點(diǎn)和前沿。
　　 半胱氨酸雙加氧酶(CDO)是一種單核非血紅素金屬蛋白酶，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞內(nèi)尤其豐富。CDO在新陳代謝和生物轉(zhuǎn)化中起著關(guān)鍵作用。CDO催化半胱氨酸(Cys)的氧化反應(yīng)生成半胱亞磺酸，這是Cys分解代

3、謝過(guò)程的第一步，在下一步的氧化過(guò)程中生成硫酸鹽或者?；撬?。CDO對(duì)于維持生物體的健康有重要作用。
　　 CDO是一種新穎的單核非血紅素金屬蛋白酶。在單核非血紅素金屬蛋白酶中，它的反應(yīng)活性中心的典型結(jié)構(gòu)是2－組氨酸－1－羧酸鹽的面型三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。然而，在CDO中，第三個(gè)組氨酸咪唑基團(tuán)取代了羧酸鹽配體的位置，形成了3－組氨酸面型三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。另外，Cys中的硫醇硫與附近的酪氨酸殘基中的C形成了一個(gè)硫醚鍵，這種罕見(jiàn)的Tyr－Cys結(jié)構(gòu)被稱(chēng)

4、為“交聯(lián)蛋白輔因子”。CDO的這些結(jié)構(gòu)特性可能會(huì)對(duì)它的催化機(jī)理產(chǎn)生影響。
　　 相比于CDO的重要性，人們對(duì)這種非血紅素酶的反應(yīng)機(jī)理卻知之甚少，且對(duì)提出的反應(yīng)機(jī)理也存在諸多爭(zhēng)論。因?yàn)镃DO的催化反應(yīng)進(jìn)行地非常快，因此利用實(shí)驗(yàn)手段很難捕捉到反應(yīng)過(guò)程中相關(guān)的中間體，這就為進(jìn)一步了解CDO帶來(lái)了困難。分子水平上的理論計(jì)算研究就顯得尤為重要，開(kāi)展相關(guān)的理論研究工作是當(dāng)今理論化學(xué)工作者面臨的一項(xiàng)重要任務(wù)。
　　 在本論文中，我們采

5、用密度泛函理論方法，對(duì)CDO及其模型化合物催化反應(yīng)機(jī)理和活性調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了理論研究，內(nèi)容涵蓋了CDO的催化反應(yīng)機(jī)理，氧氣激活機(jī)制以及CDO及其模型化合物的電子結(jié)構(gòu)特性和電荷轉(zhuǎn)移路徑等。本論文主要?jiǎng)?chuàng)新成果如下：
　　 1.用密度泛函方法詳細(xì)地研究了CDO催化Cys的反應(yīng)機(jī)理。我們以大鼠CDO(PDB ID：3ELN)的X射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)為初始構(gòu)型，選取了包含組氨酸(His86，His88和His140)，底物Cys和雙氧分子在內(nèi)的鐵的

6、反應(yīng)活性中心作為模型，討論了在單重態(tài)、三重態(tài)和五重態(tài)下，反應(yīng)路徑中關(guān)鍵點(diǎn)的幾何構(gòu)型和電子結(jié)構(gòu)，并給出了勢(shì)能面。通過(guò)研究，我們提出了新的CDO反應(yīng)機(jī)理，即“鐵近端氧”反應(yīng)機(jī)理。
　　 結(jié)果表明：在這個(gè)反應(yīng)機(jī)理中，反應(yīng)由五步組成。首先，位于Fe和S之間的O(1)－O(2)鍵的擺動(dòng)使得鐵近端氧原子O(1)接近S，而鐵遠(yuǎn)端氧原子O(2)靠近Fe，這步反應(yīng)經(jīng)過(guò)過(guò)渡態(tài)TS1生成了七元環(huán)中間體INT2。接著，隨著O(1)－O(2)鍵的斷裂和S

7、－O(1)鍵的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)，第二個(gè)氧原子O(2)被轉(zhuǎn)移到底物的S中，反應(yīng)結(jié)束并生成產(chǎn)物半胱亞磺酸。
　　 CDO的反應(yīng)主要發(fā)生在高自旋五重態(tài)的勢(shì)能面上，決速步的活化能為15.7kcal.mol-1。結(jié)合五重態(tài)勢(shì)能面上各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)的電子結(jié)構(gòu)變化，我們了解到：在第一步O(1)－O(2)鍵的擺動(dòng)過(guò)程中，一個(gè)電子從π*oo軌道遷移到σ*x2-y2軌道中。5INT2的電子組態(tài)為π*xy2π*xz1π*yz1σ*z21σ*x2-y21，其中Fe

8、的氧化態(tài)為Ⅱ。在第二步反應(yīng)中，O(1)-O(2)鍵的伸長(zhǎng)和斷裂導(dǎo)致了中間體5INT3的生成，在這個(gè)化合物中，S原子具有自由基特性(ps=0.46)，這主要是由于S原子孤對(duì)電子中的一個(gè)電子轉(zhuǎn)移到O(1)原子上造成的。與此同時(shí)，F(xiàn)e轉(zhuǎn)移了一個(gè)電子到O(2)原子上，F(xiàn)e的氧化態(tài)由5INT2中的Ⅱ變?yōu)榱?INT3中的Ⅲ。在第三步反應(yīng)中，前兩步反應(yīng)提供了足夠的空間，S-O(1)鍵的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)生成了中間體5INT4。在最后兩步反應(yīng)中，一個(gè)電子從硫氧

9、化物遷移到Fe-oxo體系中，生成了產(chǎn)物半胱亞磺酸，同時(shí)CDO中Fe的氧化態(tài)又變?yōu)棰颉?br>　　 “鐵近端氧”反應(yīng)機(jī)理是一個(gè)伴隨大量放熱的分步反應(yīng)機(jī)理。與之前de Visser課題組提出的“鐵遠(yuǎn)端氧”反應(yīng)機(jī)理相比，這兩個(gè)機(jī)理都是可行的，有競(jìng)爭(zhēng)力的反應(yīng)機(jī)理。本研究為人們進(jìn)一步了解CDO催化反應(yīng)機(jī)理提供了參考。
　　 有關(guān)結(jié)果被雜志Journal of Theoretical and Computational Chemistr

10、y接收。
　　 2.用密度泛函方法詳細(xì)地研究了CDO模型化合物在氧化反應(yīng)過(guò)程中氧氣的激活模式，通過(guò)分析電子結(jié)構(gòu)、成鍵類(lèi)型和前線(xiàn)軌道，對(duì)硫醇配體及其相對(duì)位置是如何控制氧氣激活的進(jìn)行了理論研究。我們選取了四個(gè)模型：兩個(gè)硫醇配體化合物[(iPrBIP)FeⅡ(SPh)(Cl)](A)和[(iPrBIP)FeⅡ(SPh)(OTf)](B)，兩個(gè)非硫醇配體化合物[(iPrBIP)FeⅡ(Cl)2](C)和[(iPrBIP)FeⅡ(OTf)

11、2](D)。在硫醇配體化合物中，相對(duì)于Fe的第六個(gè)開(kāi)放位點(diǎn)，模型(A)的硫醇配體位于反式位置，而模型(B)的硫醇配體位于順式位置。另外，我們也研究了氧氣激活的兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：第一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是氧氣結(jié)合到Fe的開(kāi)放位點(diǎn)之前，這可以反映氧氣激活的本質(zhì)特性；第二個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是氧氣恰好結(jié)合到開(kāi)放位點(diǎn)，而這可以反映氧氣和模型的相互作用。
　　 結(jié)果表明：硫醇配體對(duì)氧氣的激活是至關(guān)重要的，而且它的相對(duì)位置對(duì)決定氧氣激活路徑也有重要的影響。在硫醇配體模型

12、中，通過(guò)有效的相互作用，硫醇配體可以同時(shí)作為π給體和σ給體向FeⅡ轉(zhuǎn)移電荷。一方面，這降低了FeⅡ的有效核電荷和氧化還原勢(shì)；另一方面，通過(guò)降低結(jié)構(gòu)的Lewis酸性，較強(qiáng)的電子給予能力降低了氧氣分子的結(jié)合能。硫醇配體為氧氣的激活提供了必要條件。硫醇配體的相對(duì)位置也對(duì)氧氣的激活起著重要的作用。當(dāng)硫醇配體結(jié)合到反式位置時(shí)，F(xiàn)e的d軌道將會(huì)成為最高占據(jù)軌道，并作為σ給體向O(1)2p軌道轉(zhuǎn)移電荷，這將導(dǎo)致Fe的氧化和Fe-S鍵的斷裂。當(dāng)硫醇配體

13、結(jié)合到順式位置時(shí)，S的π分子軌道將占據(jù)最高雙占據(jù)軌道，并作為σ給體向O(2)轉(zhuǎn)移電荷，從而導(dǎo)致硫醇配體中的S發(fā)生氧化反應(yīng)。
　　 結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們關(guān)聯(lián)了這四個(gè)(iPrBIP)FeⅡ化合物的氧化還原電勢(shì)和在反應(yīng)過(guò)程中的電荷轉(zhuǎn)移量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫醇配體的電荷轉(zhuǎn)移量和相關(guān)的氧化還原勢(shì)是密切相關(guān)的。電荷轉(zhuǎn)移量越多，氧化還原勢(shì)越低。這意味著我們可以通過(guò)調(diào)整配體的電荷轉(zhuǎn)移能力來(lái)改進(jìn)相關(guān)的模型。
　　 本研究為進(jìn)一步了解CDO氧氣激活

14、機(jī)制提供了理論依據(jù)。
　　 有關(guān)結(jié)果發(fā)表在J.Phys.Chem.A(2012，116，5510-5517)雜志上。
　　 3.用密度泛函方法詳細(xì)地研究了CDO模型化合物和反應(yīng)活性中心以及它們相應(yīng)的硒代化合物，在通過(guò)氧氣激活進(jìn)行催化反應(yīng)的前兩步反應(yīng)中，通過(guò)分析成鍵類(lèi)型，前線(xiàn)軌道和電荷轉(zhuǎn)移路徑，對(duì)為什么CDO不能催化Sec的氧化而可以催化Cys的氧化的問(wèn)題進(jìn)行了理論研究，盡管Se的電荷轉(zhuǎn)移能力要強(qiáng)于S。我們選取了兩個(gè)模型：

15、一個(gè)CDO模型化合物和一個(gè)CDO反應(yīng)活性中心(PDB ID：3ELN)。根據(jù)文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道出的CDO催化機(jī)理，對(duì)前兩步反應(yīng)過(guò)程中公認(rèn)的三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)結(jié)構(gòu)A，B和C進(jìn)行了研究。它們分別是氧氣結(jié)合到Fe的第六個(gè)開(kāi)放位點(diǎn)之前的結(jié)構(gòu)A，氧氣恰好結(jié)合到開(kāi)放位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)B和氧氣進(jìn)攻S生成四元環(huán)的結(jié)構(gòu)C。
　　 結(jié)果表明：在O2結(jié)合過(guò)程的第一步反應(yīng)中，CDO硒代化合物中Se向Fe轉(zhuǎn)移電荷的能力要強(qiáng)于S。以CDO模型化合物為例，在結(jié)構(gòu)A中，自旋向上的電

16、子成單地占據(jù)在Fe的四個(gè)d軌道中，F(xiàn)e的氧化態(tài)為Ⅱ。當(dāng)結(jié)合了O2，在結(jié)構(gòu)B中，F(xiàn)e將d軌道中的電荷轉(zhuǎn)移到OOπ*軌道中，F(xiàn)e的氧化態(tài)變?yōu)棰?。這個(gè)結(jié)構(gòu)與三價(jià)鐵過(guò)氧化物的特性一致。而在Se-CDO模型化合物中，F(xiàn)e也將d軌道中的電荷轉(zhuǎn)移到OOπ*軌道中，但由于Se更好的電荷轉(zhuǎn)移能力，它可以通過(guò)將Se4p軌道的電荷轉(zhuǎn)移到Fe的d軌道來(lái)補(bǔ)償Fe中心的電荷損失。這樣，在Se-CDO模型化合物的結(jié)構(gòu)B中，F(xiàn)e的氧化態(tài)保持Ⅱ。
　　 在第二步

17、反應(yīng)，四元環(huán)結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程中，S的電荷給予能量強(qiáng)于Se。隨著四元環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，S(Se)-O(2)鍵生成，同時(shí)Fe-O(1)鍵被削弱。在CDO模型化合物的結(jié)構(gòu)C中，一方面，S將S3p軌道的電荷轉(zhuǎn)移到OOπ*軌道，與OOπ*軌道中的一個(gè)電子配對(duì)；另一方面，S可以向Fe的d軌道轉(zhuǎn)移電荷。在這個(gè)過(guò)程中，F(xiàn)e的氧化態(tài)重新變?yōu)棰?。而在Se-CDO模型化合物的結(jié)構(gòu)C中，相比于Fe-S鍵，F(xiàn)e-Se鍵被更大地削弱了，Se只將Se4p軌道的電荷轉(zhuǎn)移到O

18、Oπ*軌道，而不是轉(zhuǎn)移給Fe。在反應(yīng)過(guò)程中，F(xiàn)e始終保持Ⅱ價(jià)的氧化態(tài)。
　　 與模型化合物相似，在CDO反應(yīng)活性中心中，F(xiàn)e中心氧化態(tài)的變化是Ⅱ→Ⅲ→Ⅱ，而在Se-CDO反應(yīng)活性中心中，F(xiàn)e中心的氧化態(tài)始終保持Ⅱ價(jià)。
　　 在催化反應(yīng)的前兩步反應(yīng)中，S和Se之間的電荷轉(zhuǎn)移競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致了Fe中心氧化態(tài)的不同變化?？紤]到三價(jià)鐵過(guò)氧化物是這類(lèi)反應(yīng)中的活性氧化劑，所以，半胱氨酸化合物的Fe中心可以有效地催化O(1)-O(2)鍵的斷裂