簡介：目的以青年患者為研究對象，觀察異氟烷和丙泊酚對青年患者心臟瓣膜置換術(shù)后早期認知功能和血清S100B、NSE和MDA的影響。方法30例因患風心病行瓣膜置換術(shù)的18～45歲的青年患者，隨機分兩組，異氟烷組（Ⅰ組）15例，丙泊酚組P組15例。兩組患者均采用靜脈注射咪達唑侖01MGKG1，芬太尼5ΜGKG1及維庫溴銨01MGKG1麻醉誘導，氣管插管后機控呼吸，在心肺轉(zhuǎn)流術(shù)下行心內(nèi)直視手術(shù)。Ⅰ組以吸入異氟烷復合芬太尼、咪達唑侖、維庫溴銨靜脈注射維持麻醉，吸入異氟烷呼末最低肺泡有效濃度MAC維持在15左右。P組用丙泊酚4～6MGKG1H1持續(xù)泵入，復合芬太尼、咪達唑侖、維庫溴銨靜脈注射維持麻醉。分別于麻醉前T1、轉(zhuǎn)機前即刻T2停機后即刻T3、停機后8HT4、停機后24HT5抽血測定血清S100B蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE、丙二醛MDA含量。并于手術(shù)前1天，手術(shù)后第7天應(yīng)用簡易智力量表MMSE、焦慮自評量表SAS和抑郁自評量表SDS進行測試，MMSE評分較術(shù)前基礎(chǔ)值下降1個標準差認為有認知功能障礙發(fā)生。結(jié)果1患者一般情況兩組無統(tǒng)計學差異，血流動力學指標、血氣指標、心肺轉(zhuǎn)流時間、主動脈阻斷時間、換瓣個數(shù)也無統(tǒng)計學差異（P＞005）。2S100BⅠ組與P組比較在T1、T2、T5時點無統(tǒng)計學差異P＞005，T3、T4時點有顯著統(tǒng)計學意義P＜001組內(nèi)T3、T4時點S100B濃度分別與T1、T2、T5時點比較有顯著統(tǒng)計學意義P＜001，在T3時點S100B濃度最高。3NSEⅠ組與P組比較T3、T4時點NSE濃度有顯著統(tǒng)計學意義（P＜001），組內(nèi)T3、T4時點NSE濃度明顯升高，分別與T1、T2比較有顯著統(tǒng)計學意義（P＜001）。4MDAⅠ組和P組比較T1、T2、T4、T5時點MDA濃度無統(tǒng)計學差異P＞005，T3時點有統(tǒng)計學意義P＜005組內(nèi)T3、T4濃度明顯升高，分別與T1、T2、T5比較有顯著統(tǒng)計學意義P＜001。5SAS，SDS，MMSE量表評估術(shù)前1D，術(shù)后7D，SAS，SDS標準評分均＜50分，組間和組內(nèi)比較各時點均無統(tǒng)計學意義P＞005。MMSE評分Ⅰ組和P組比較術(shù)前1D、術(shù)后7D均無統(tǒng)計學意義P＞005。組內(nèi)比較各組的MMSE評分術(shù)后7D要明顯低于術(shù)前1D，有統(tǒng)計學意義（Ⅰ組P＜001P組P＜005）。MMSE評分術(shù)后7D，術(shù)前1D比較，以低于1個標準差確定為發(fā)生了認知功能障礙為標準，結(jié)果顯示，異氟烷組和丙泊酚組都有POCD患者發(fā)生，異氟烷組發(fā)生6例，丙泊酚組發(fā)生4例，經(jīng)四格表資料卡方檢驗的精確概率檢驗法分析兩組無統(tǒng)計學差異P＞005。結(jié)論通過異氟烷和丙泊酚對青年患者心臟瓣膜置換術(shù)后早期認知功能的影響研究，在本實驗觀察例數(shù)內(nèi)得出以下結(jié)論1在異氟烷麻醉和丙泊酚麻醉下，青年患者心臟瓣膜置換術(shù)后早期認知功能都有下降。2在異氟烷和丙泊酚麻醉下的青年患者心臟瓣膜置換術(shù)中，S100B，NSE，MDA均升高，異氟烷麻醉下的血清濃度要顯著高于丙泊酚麻醉。提示異氟烷麻醉下青年患者心臟瓣膜置換術(shù)后的腦損傷作用可能要高于丙泊酚麻醉。

簡介：腸道病毒71型（ENTEROVIRUS71，EV71）是導致嬰幼兒感染的重要病原之一，可引起多種疾病，具有較廣的疾病譜。其中由EV71引起的兒童手足口病（H，F(xiàn)OOT，MOUTHDISEASE，HFMD）最為常見，而且在嬰幼兒容易造成腦干腦炎等神經(jīng)系統(tǒng)感染導致死亡。EV71近年有多地區(qū)流行的趨勢。EV71在分類上屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，基因組為正鏈單股RNA?；蚪M全長7500BP，編碼區(qū)僅有一個開放閱讀框（F），編碼約2200個氨基酸的多聚蛋白（POLYPROTEIN），該多聚蛋白可進一步被水解成P1、P2、P3三個前體蛋白，P1蛋白在3CD蛋白酶的切割作用下生成VP1、VP2、VP3與VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白。其中VP1、VP2和VP3裸露于病毒顆粒的表面，VP4位于病毒顆粒衣殼內(nèi)側(cè)與基因組RNA緊密連接，共同構(gòu)成EV71的抗原區(qū)。研究資料表明，雖然該病毒主要抗原決定區(qū)位于VP1，但是VP2、VP3以及VP4上均有抗原抗體結(jié)合功能；已有的實驗結(jié)果顯示單獨的VP1和VP3免疫原性有限，若能獲得VP1～VP4，免疫原性將會得到明顯提高。鑒于此，我們首先對從流行區(qū)分離的EV71病毒進行了血清學和分子生物學方面的鑒定，采用RTPCR的方法克隆了P1和3CD基因，借助于載體PCDNA30BA構(gòu)建雙順反子穿梭質(zhì)粒PSHUTTLECMVP13CD和單基因的穿梭質(zhì)粒PSHUTTLECMVP1與PSHUTTLECMV3CD。經(jīng)同源重組獲得了重組腺病毒質(zhì)粒RADP13CD、RADP1、RAD3CD，分別轉(zhuǎn)染293細胞進行包裝，獲得相應(yīng)的重組腺病毒RADP13CD、RADP1和RAD3CD，經(jīng)RTPCR檢測表明，三個重組腺病毒均已轉(zhuǎn)錄目的基因MRNA；免疫熒光和免疫組化檢測結(jié)果表明僅雙順反子重組腺病毒RADP13CD中可檢測到特異性目的蛋白，而RADP1、RAD3CD中未能檢測到特異性的表達產(chǎn)物，結(jié)果表明重組腺病毒可有效表達EV71P1和3CD基因，僅含P1或3CD基因的重組腺病毒表達產(chǎn)物未能被特異性抗體所識別，而含P1及3CD蛋白酶基因的雙順反子重組腺病毒表達產(chǎn)物具有EV71特異抗原性，提示P1蛋白只有在3CD蛋白酶的切割作用下才具有抗原性；重組腺病毒通過滴鼻、灌胃和皮下注射的方式分別免疫BALBC小鼠，ELISA法檢測結(jié)果表明實驗組小鼠血清中均檢測到抗EV71特異性IGG的抗體，且由RADP13CD免疫后產(chǎn)生的抗體水平明顯高于RADP1和RAD3CD共免疫產(chǎn)生的抗體水平；三種不同的免疫方式結(jié)果證明，灌胃免疫方式最佳，滴鼻次之，皮下注射產(chǎn)生的抗體水平最低。目前有限次數(shù)的中和試驗還未能在實驗組血清中檢測到EV71特異性保護作用，其原因還有待進一步研究。本實驗成功克隆了包含EV71全部結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)基因P1和具有切割作用的蛋白酶3CD，初步探索了EV71病毒蛋白之間的相互作用，為研究EV71結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白之間的關(guān)系打下了基礎(chǔ)；為找尋最合理的相關(guān)重組腺病毒疫苗的免疫方式做了初步的探索實驗，為EV71基因工程疫苗的研究做了前期的基礎(chǔ)工作。

簡介：點擊查看更多基于日本腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)的疫苗研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：研究目的1研究乙肝病毒核心蛋白HEPATITISBVIRUSCEPROTEIN，HBC對人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶HUMANTELOMERASEREVERSETRANASEHTERT表達的調(diào)控作用。2驗證HTERT在HBC調(diào)控肝癌細胞生長、增殖中的關(guān)鍵作用。3探討乙肝病毒核心蛋白HBC調(diào)控HTERT表達的分子機制。研究方法1HBC蛋白影響肝癌細胞生長的體內(nèi)試驗研究課題組前期試驗結(jié)果顯示，HBC可在體外增強肝癌細胞的生長及克隆增殖能力。本論文在此研究基礎(chǔ)上，利用裸鼠皮下成瘤模型在體內(nèi)進一步驗證該現(xiàn)象。將HEPG2215細胞（1107個02ML）皮下接種裸鼠，經(jīng)10D左右腫瘤直徑達05CM。將成瘤小鼠隨機分為兩組，每隔3D分別注射2UGPSHRNAHBC質(zhì)粒和PSHRNANC質(zhì)粒，每隔1D測量腫瘤直徑大小，計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。2W后，處死裸鼠，取出瘤體，稱量瘤重。同時，提取腫瘤組織總RNA，RTPCR檢測HTERT和HBCMRNA的表達情況。2HBC蛋白對HTERT基因表達的調(diào)控作用21HBC蛋白對HTERT表達的影響課題組前期實驗結(jié)果顯示，HBC可以促進BEL7402細胞中HTERTMRNA的表達，同時PSHRNAHBC亦可抑制HEPG2215細胞中HTERTMRNA的表達。本論文在此基礎(chǔ)上，將PCDNA3HBCHA質(zhì)粒和PCDNA3質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入BEL7402、HELA以及HEPG2細胞中，培養(yǎng)48H后提取總蛋白，WESTERNBLOT檢測HTERT的蛋白的表達情況。同時為了進一步檢測HTERT的表達定位情況，我們在HELA細胞中分別轉(zhuǎn)入PCDNA3HBCHA質(zhì)粒和PCDNA3質(zhì)粒，48H后進行免疫熒光實驗，使用熒光抗體標記HTERT蛋白，DAPI染核后利用熒光顯微鏡觀察HTERT的表達及定位情況。22肝細胞肝癌組織標本中HBC與HTERT表達的相關(guān)性分析上述細胞試驗完成后，我們又選取了16例肝細胞肝癌HEPATOCELLULARCARCINOMAHCC組織標本，分別提取各樣本的RNA和蛋白質(zhì)，RTPCR檢測每例標本中HBC表達情況后，將各組織標本分為HBC陽性和HBC陰性兩組。利用WESTERNBLOT比較這兩組標本中HTERT蛋白的表達情況，光密度掃描分析蛋白表達強度，最后繪制散點圖，統(tǒng)計學分析兩組標本中HTERT蛋白表達的差異。3HTERT在HBC促進肝癌細胞生長中的作用為了進一步研究HBC，HTERT和細胞增長之間的關(guān)系，我們將HTERTSI或NCSI與PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達載體共轉(zhuǎn)染至BEL7402細胞中，繪制生長曲線并進行克隆形成試驗，檢測BEL7402細胞的生長、增殖情況。另一方面，將HTERTSI或NCSI與HBC干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEPG2215細胞，繪制生長曲線并進行克隆形成試驗，檢測HEPG2215細胞生長、增殖情況，反向驗證HTERT在HBC促進肝癌細胞生長中的作用。4HBC對HTERT啟動子活性的調(diào)控機制研究41HBC對HTERT核心啟動子的調(diào)控作用為了明確HBC影響HTERT表達的機制，將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達載體與攜帶有HTERT核心啟動子的報告基因質(zhì)粒PGL3BHTERT371分別共轉(zhuǎn)染至BEL7402，HEPG2細胞，同時轉(zhuǎn)染PRLTK作為內(nèi)參質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24H后裂解細胞，利用96孔化學發(fā)光儀檢測樣品熒光強度，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。另一方面，將PSHRNAHBC或PSHRNANC與攜帶有HTERI核心啟動子的報告基因質(zhì)粒PGL3BHTERT371，以及內(nèi)參質(zhì)粒PRLTK共轉(zhuǎn)染HEPG2215細胞，轉(zhuǎn)染24H后裂解細胞，利用96孔化學發(fā)光儀檢測樣品熒光強度，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，反向驗證HBC對HTERT核心啟動子的調(diào)控作用。42HBC調(diào)節(jié)HTERT啟動子活性關(guān)鍵區(qū)域的尋找為進一步明確HBC調(diào)節(jié)HTERT啟動子活性的關(guān)鍵區(qū)域，將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達載體與一系列截短缺失的HTERT啟動子報告基因載體和內(nèi)參質(zhì)粒PRLTK共轉(zhuǎn)染至BEL7402和HEPG2細胞。轉(zhuǎn)染24H后裂解細胞，利用96孔化學發(fā)光儀檢測樣品熒光強度。另一方面，利用PSHRNAHBC封閉HBC的表達后，將一系列截短缺失的HTERT啟動子報告基因載體和內(nèi)參質(zhì)粒PRLTK共轉(zhuǎn)染至HEPG2215細胞。轉(zhuǎn)染24H后裂解細胞，利用96孔化學發(fā)光儀檢測樣品的熒光強度。43HBC調(diào)節(jié)HTERT啟動子活性關(guān)鍵位點的尋找明確HBC影響HTERT啟動子活性的關(guān)鍵區(qū)域后，我們通過相應(yīng)的文獻1分析了關(guān)鍵區(qū)域中包含的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，其中包括CETS2的結(jié)合位點。結(jié)合相關(guān)的文獻2，轉(zhuǎn)錄因子CETS2在調(diào)控和維持HTERT基因啟動子的活性中發(fā)揮重要作用。因此，我們設(shè)計并構(gòu)建了CETS2結(jié)合位點突變的HTERT核心啟動子報告基因載體，將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達載體與CETS2結(jié)合位點突變或野生型HTERT核心啟動子報告基因載體，以及內(nèi)參質(zhì)粒PRLTK分別共轉(zhuǎn)染BEL7402細胞，轉(zhuǎn)染24H后裂解細胞，利用96孔化學發(fā)光儀檢測樣品熒光強度。另一方面，將PSHRNAHBC或PSHRNANC與CETS2結(jié)合位點突變或野生型HTERT核心啟動子報告基因載體，以及內(nèi)參質(zhì)粒PRLTK共轉(zhuǎn)染HEPG2215細胞，轉(zhuǎn)染24H后裂解細胞，利用96孔化學發(fā)光儀檢測樣品的熒光強度。5CETS2蛋白及相關(guān)信號通路分子在HBC調(diào)控HTERT表達中的作用研究51HBC對CETS2蛋白核轉(zhuǎn)位的影響結(jié)合文獻報道3，CETS2蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用依賴于其從胞漿到胞核的轉(zhuǎn)位過程。因此，我們將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達載體轉(zhuǎn)染HEPG2細胞，轉(zhuǎn)染24H后，分別提取兩組細胞的胞核蛋白和胞漿蛋白，通過WESTERNBLOT檢測CETS2蛋白在胞質(zhì)、胞核中的表達變化，明確HBC是否影響CETS2蛋白的核轉(zhuǎn)位。52HCC組織標本中HBC表達與CETS2蛋白細胞定位的相關(guān)性分析在細胞實驗的基礎(chǔ)上，我們又提取了上述HCC組織標本的胞漿、胞核蛋白，WESTERNBLOT檢測HBC陽性和HBC陰性兩組標本中CETS2蛋白的細胞定位情況，光密度掃描分析蛋白表達強度，最后做出散點圖進行統(tǒng)計學相關(guān)性分析。53CETS2在HBC調(diào)控HTERT基因表達中的作用為了進一步驗證CETS2在HBC調(diào)節(jié)HTERT表達中的關(guān)鍵作用，我們將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達載體與CETS2SI或NCSI分別共轉(zhuǎn)染HEPG2細胞，24H后提取RNA，RTPCR檢測HTERT基因MRNA的表達情況。54HBC對ERK通路活化的影響已有文獻報道3，ERK信號通路的活化可磷酸化CETS2蛋白，進而促進其核轉(zhuǎn)位過程。因此，我們將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達載體分別轉(zhuǎn)染HELA和HEPG2細胞，24H、36H和48H后提取細胞總蛋白，WESTERNBLOT檢測PERK12的表達情況，驗證HBC是否影響ERK信號通路的活化。研究結(jié)果1HBC蛋白可促進肝癌細胞的體內(nèi)生長在裸鼠成瘤實驗中，檢測裸鼠體內(nèi)腫瘤體積大小和瘤重等指標，結(jié)果顯示PSHRNAHBC注射組的腫瘤的體積和瘤重均明顯小于PSHRNANC質(zhì)粒注射組（P＜005）。RTPCR顯示PSHRNAHBC注射組腫瘤組織中HTERT的MRNA表達量明顯低于對照組。2HBC可上調(diào)HTERT蛋白的表達21HBC可上調(diào)肝癌細胞系中HTERT蛋白的表達將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達載體轉(zhuǎn)染至BEL7402，HELA，HEPG2細胞，WESTERNBLOT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBC表達載體組細胞HTERT蛋白表達量顯著高于轉(zhuǎn)染空載體組（P＜005）。同時免疫熒光結(jié)果顯示，HTERT蛋白主要定位于細胞核內(nèi)，過表達HBC可以顯著提高HELA細胞中HTERT蛋白的表達。22HBC陽性肝癌組織中HTERT蛋白的表達顯著升高選取16例HCC組織標本，分別提取各樣本的RNA和蛋白質(zhì)，通過RTPCR將各組織標本分為6例HBC陰性標本和10例HBC陽性標本。WESTERNBLOT檢測HTERT蛋白的表達，結(jié)果蛋白條帶進行光密度掃描，計算相對表達量HTERTΒACTIN，統(tǒng)計學分析顯示HBC陽性HCC標本中HTERT蛋白表達水平顯著高于HBC陰性組（P＜005）。3HTERT在HBC促進肝癌細胞生長中發(fā)揮重要作用生長曲線和克隆形成試驗的結(jié)果顯示，過表達HBC可以增強BEL7402細胞的生長和克隆形成能力（P＜005），但HTERTSI的轉(zhuǎn)入使細胞生長顯著受抑制，且可逆轉(zhuǎn)HBC對細胞生長和克隆增殖的促進作用P＞005。另一方面，小干擾RNA封閉HBC的表達后HEPG2215細胞的增殖和克隆形成率受到明顯抑制（P＜005），但HTERTSI亦可導致細胞生長速度的減慢，且可消除PSHRNAHBC和PSHRNANC轉(zhuǎn)染組間細胞生長和克隆形成能力的差異（P＞005）。以上結(jié)果從正反兩方面驗證了HTERT在HBC促進肝癌細胞生長、增殖過程中發(fā)揮重要作用。4HBC對HTERT啟動子活性的調(diào)控機制研究41HBC蛋白上調(diào)HTERT核心啟動子的活性共轉(zhuǎn)染及雙熒光檢測結(jié)果顯示，在BEL7402細胞中，隨著HBC蛋白表達量的升高，HTERT核心啟動子的活性被顯著上調(diào)（P＜0001），且具有明顯劑量依賴性HEPG2細胞中，轉(zhuǎn)染HBC組HTERT核心啟動子的活性亦明顯高于轉(zhuǎn)染空載體組（P＜005）。另一方面，在HEPG2215細胞中，小干擾RNA封閉HBC的表達可明顯下調(diào)HTERT核心啟動子的活性（P＜005）。以上結(jié)果顯示，HBC可上調(diào)HTERT核心啟動子的活性。42HTERT啟動子130～197BP區(qū)域是HBC發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵區(qū)段共轉(zhuǎn)染及雙熒光檢測結(jié)果顯示，HBC的過表達可以上調(diào)BEL7402和HEPG2細胞中PGL3BHTERT371，PGL3BHTERT306，PGL3BHTERT197啟動子報告基因的活性（P＜005），而HBC對PGL3BHTERT130啟動子的活性無明顯影響另一方面，小干擾RNA封閉HBC的表達可顯著降低HEPG2215細胞中PGL3BHTERT371，PGL3BHTERT306，PGL3BHTERT197啟動子報告基因的活性，而不影響PGL3BHTERT130啟動子的活性。以上結(jié)果表明，HBC可能通過HTERT啟動子130～197BP區(qū)域來促進HTERT基因的轉(zhuǎn)錄。43轉(zhuǎn)錄因子CETS2結(jié)合位點是HBC激活HTERT啟動子的關(guān)鍵位點相關(guān)文獻報道1，在130～197BP區(qū)域內(nèi)存在著CETS2，BHLH2，AP2，NFE2AP2四個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。鑒于轉(zhuǎn)錄因子CETS2在維持HTERT轉(zhuǎn)錄活性中的關(guān)鍵作用，我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子CETS2結(jié)合位點突變的HTERT核心啟動子報告質(zhì)粒PGL3BCETSMUT。將PGL3BCETSMUT或野生型PGL3BHTERT371啟動子報告基因載體與PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達載體分別共轉(zhuǎn)染BEL7402細胞。轉(zhuǎn)染24H后提取蛋白，雙熒光檢測結(jié)果顯示，HBC的過表達明顯上調(diào)野生型PGL3BHTERT371啟動子報告基因的活性P＜005，而對PGL3BCETSMUT啟動子報告基因的活性無明顯影響。另一方面，在HEPG2215細胞中，將PSHRNAHBC或PSHRNANC與PGL3BCETSMUT或野生型PGL3BHTERT371啟動子報告基因載體共轉(zhuǎn)染HEPG2215細胞，轉(zhuǎn)染24H后裂解細胞，雙熒光檢測結(jié)果顯示，小干擾RNA封閉HBC的表達明顯抑制野生型PGL3BHTERT371啟動子報告基因的活性P＜005，而不影響CETS2結(jié)合位點突變的PGL3BCETSMUT啟動子的活性。以上結(jié)果提示，轉(zhuǎn)錄因子CETS2結(jié)合位點為HBC調(diào)控HTERT啟動子活性的關(guān)鍵位點。5CETS2蛋白及相關(guān)信號通路分子在HBC調(diào)控HTERT表達中發(fā)揮重要作用51HBC可促進肝癌細胞中CETS2蛋白的核轉(zhuǎn)位WESTERNBLOT結(jié)果顯示，HEPG2細胞中HBC的過表達可以使CETS2蛋白的胞核表達水平顯著升高，而胞漿表達降低。該結(jié)果提示HBC可促進細胞中CETS2蛋白的核轉(zhuǎn)位。52HBC陽性HCC組織中胞核CETS2蛋白的表達略有升高WESTERNBLOT檢測HCC組織中CETS2蛋白的胞核表達，條帶進行光密度掃描，計算相對表達量CETS2LAMINAC，結(jié)果顯示，HBC陽性HCC組織胞核CETS2蛋白的表達水平略高于HBC陰性HCC組織，但統(tǒng)計學分析未見顯著性差異（P＞005）。53CETS2蛋白在HBC調(diào)控HTERT基因表達中發(fā)揮關(guān)鍵作用在HEPG2細胞中共轉(zhuǎn)染PCDNA3HBCHA或PCDNA3與CETS2SI，RTPCR結(jié)果顯示，與NCSI轉(zhuǎn)染組相比，CETS2SI可顯著下調(diào)HTERTMRNA的表達水平，且可消除PCDNAHBCHA對HTERT表達的上調(diào)作用。54HBC蛋白可促進ERK通路的活化WESTERNBLOT結(jié)果顯示，在HELA細胞中，與對照組相比，PCDNA3HBC轉(zhuǎn)染后36H、48H即可促進PERK12的表達，同時HTERT蛋白的表達亦被明顯上調(diào)在HEPG2細胞中，HBC蛋白亦可以促進PERK12的表達。結(jié)合文獻，以上結(jié)果提示ERK通路的活化可能參與了HBC對HTERT蛋白表達和CETS2蛋白核轉(zhuǎn)位的調(diào)控作用。結(jié)論1HBC蛋白可促進肝癌細胞在體內(nèi)的生長。2HBC可劑量依賴性地上調(diào)HTERT蛋白的表達，且HTERT在HBC促進肝癌細胞生長中發(fā)揮重要作用。3HBC蛋白可上調(diào)HTERT啟動子的活性，且轉(zhuǎn)錄因子CETS2結(jié)合位點是HBC發(fā)揮調(diào)控作用的的關(guān)鍵位點。4CETS2蛋白及相關(guān)信號通路分子在HBC調(diào)控HTERT表達中發(fā)揮著重要的作用。意義1該課題第一次提出了HBC對HTERT表達的調(diào)控作用，驗證了HTERT在HBC調(diào)控肝癌細胞生長、增殖中的關(guān)鍵作用，為揭示HBC參與肝癌發(fā)生的分子機制提供了直接的實驗依據(jù)。2首次對HBC調(diào)控HTERT表達的分子機制進行了深入研究，確定CETS2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點為HBC調(diào)控HTERT啟動子活性的關(guān)鍵位點，并明確了CETS2蛋白核轉(zhuǎn)位在HBC上調(diào)HTERT表達中的關(guān)鍵作用，為HBC蛋白調(diào)控基因表達的通路研究提供了新的數(shù)據(jù)。

簡介：目的了解河北省不同地區(qū)、不同人群中肝炎病毒的感染狀況和流行趨勢，掌握其流行特征，分析該省人群中肝炎病毒的感染相關(guān)因素，評價人群乙肝疫苗接種效果，為乙肝的科學防控提供基礎(chǔ)。方法2011年在河北地區(qū)常駐人口中開展血清流行病學研究，運用多階段整群系統(tǒng)隨機抽樣方法，隨機抽取22個縣區(qū)，按照系統(tǒng)抽樣法抽取縣區(qū)內(nèi)以家庭為單位的1～59歲居民，進行問卷調(diào)查，并同時靜脈采血5ML。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA檢測血樣中乙肝病毒表面抗原HBSAG、乙肝病毒表面抗體抗HBS和乙肝病毒核心抗體抗HBC。利用EPIDATA310軟件對調(diào)查問卷及檢測結(jié)果進行雙錄入，運用EXCEL和EPIINFO軟件進行數(shù)據(jù)整理和分析。結(jié)果1本次調(diào)查全省11個市的22個縣（區(qū)），共抽樣5072人，有流行病學調(diào)查資料和有實驗室檢測結(jié)果的有效樣本4567人，應(yīng)答率為9004％。調(diào)查城市人口2311人，農(nóng)村人口2256人，分別占調(diào)查總?cè)丝诘?060％和4940％。男、女性別比為1∶106。2全省1～59歲人群HBSAG、抗HBS、抗HBC分別為331％、4335％、2967％。其中HBSAG陽性率最高的廊坊499％，最低的是唐山127％石家莊抗HBS陽性率最高，為56％。3城鄉(xiāng)人群HBSAG陽性率存在統(tǒng)計學差異，農(nóng)村高于城市城市人群抗BS陽性率高于農(nóng)村，差異存在統(tǒng)計學意義農(nóng)村人群抗HBC陽性率高于城市，存在統(tǒng)計學差異。41～4歲調(diào)查人群乙肝疫苗全程接種率和首針及時接種率分別為9405％、9405％，5～19歲調(diào)查人群乙肝疫苗全程接種率和首針及時接種率分別為7090％、5543％。年齡愈大，乙肝疫苗全程接種率和首針及時接種率愈低。5將14個因素與乙肝HBSAG陽性的關(guān)系通過用LOGISTIC回歸模型進行分析，發(fā)現(xiàn)家庭有HBSAG陽性成員是影響乙肝感染的危險因素。結(jié)論1河北省人群HBSAG陽性率為331％，與1992年調(diào)查的HBSAG陽性率相比，HBSAG陽性率明顯下降。按照世界衛(wèi)生組織分類標準，我省處于中流行區(qū)（8％＞HBSAG陽性率≥2％）。2河北省已經(jīng)實現(xiàn)2006～2010年全國乙型病毒性肝炎防治規(guī)劃全人群HBSAG陽性率將至7％以下的控制目標。3河北省農(nóng)村地區(qū)HBSAG陽性率高于城市，15～29歲人群陽性率最高，以男性為主。4HBSAG陽性率與文化程度呈負相關(guān)不同民族HBSAG陽性率亦不相同。5乙肝疫苗接種已有大幅提高，低年齡組全程接種率及首針及時率農(nóng)村與城市已無差別。6通過用LOGISTIC回歸模型對調(diào)查的多種影響因素進行分析，發(fā)現(xiàn)家庭有HBSAG陽性成員是影響乙肝感染的危險因素。7人群抗HBS陽性率水平較1992年明顯上升，乙肝疫苗接種已取得顯著效果。

簡介：分類號學號200878405學校代碼10487密級博士學位論文博士學位論文中國中國45歲以上歲以上人群人群首發(fā)卒中首發(fā)卒中后認知障礙認知障礙的調(diào)查的調(diào)查學位申請人張勇學科專業(yè)神經(jīng)病學指導教師張?zhí)I教授張振馨教授答辯日期2011年5月獨創(chuàng)性聲明獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明，本學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果的總結(jié)。盡我所知，除文中已經(jīng)標明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本文的研究做出貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本人將承擔本聲明引起的一切法律后果。學位論文作者簽名日期年月日學位論文版權(quán)使用授權(quán)書學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解學校有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即學校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)華中科技大學可以將本學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存和匯編本學位論文。保密√□，在年解密后適用本授權(quán)書。本論文屬于不保密□。（請在以上方框內(nèi)打“√”）學位論文作者簽名指導教師簽名日期年月日日期年月日

簡介：研究背景系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE是自身免疫介導的以慢性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病，以青年女性多見，可累及人體的多個器官系統(tǒng)，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)是最重要的受累器官之一。SLE患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累，將發(fā)生一系列神經(jīng)精神癥狀，我們將其稱為神經(jīng)精神性狼瘡NPSLE。1999年，美國風濕病學會ACR定義NPSLE是指在排除其它原因引起的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，由SLE引起的包括中樞、周圍和自主神經(jīng)系統(tǒng)的19種神經(jīng)精神癥狀。其中認知功能障礙CI是19種精神神經(jīng)癥狀表現(xiàn)之一。據(jù)國內(nèi)外文獻報道，SLE患者認知功能障礙的發(fā)生率為21％80％不等，主要表現(xiàn)為注意力不集中、記憶困難、找詞困難、詞語不連貫等。在臨床上通常隱襲起病，許多患者病情穩(wěn)定，早期沒有明顯的精神神經(jīng)表現(xiàn)，多數(shù)為臨床醫(yī)生所忽略，直至病情嚴重如癡呆時才被診斷。也有學者認為SLE患者存在認知方面的障礙比所報道的還要高。目前SLE患者發(fā)生認知功能障礙的機制還不完全清楚，普遍認為可能與血管病變、血腦屏障破壞、抗神經(jīng)元抗體以及抗體對神經(jīng)元的直接破壞有關(guān)。并強調(diào)SLE患者早期認知功能的損傷具有可逆性。所以，臨床上早期發(fā)現(xiàn)、診斷及經(jīng)過適當?shù)闹委熓軗p的認知功能，對病情的改善、預后都至關(guān)重要。近年來有較多學者研究發(fā)現(xiàn)，超敏C反應(yīng)蛋白HSCRP水平與各種原因引起的認知功能障礙存在明顯相關(guān)，推測原因可能是HSCRP對腦血管和神經(jīng)細胞起直接或間接的毒性作用。這些發(fā)現(xiàn)為臨床判斷認知功能障礙提供了實驗依據(jù)，成為目前研究熱點，但其確切發(fā)生機理尚有爭論，需要進一步深入研究。根椐目前有關(guān)資料，國外有關(guān)SLE患者認知功能障礙與HSCRP的相關(guān)關(guān)系的研究報道不多，國內(nèi)至今也未見到相關(guān)研究報道。因此，探討國人HSCRP與SLE認知功能障礙的關(guān)系，可為臨床上早期診斷、治療提供一定的實驗和理論依據(jù)，具有重要意義。研究目的探明我國系統(tǒng)性紅斑狼瘡女性患者血清HSCRP水平與認知功能障礙之間的相關(guān)性，對臨床上早期診斷女性SLE患者認知功能障礙，早期治療、改善預后提供實驗和理論依據(jù)。研究方法1選取女性SLE患者90例，填寫病例調(diào)查表，詳細記錄每位入選病例的一般情況，包括年齡，身高體重，文化程度，病程，目前治療情況，病情活動度等。2對每位患者進行蒙特利爾認知功能評估MOCA北京版，并同步采集每位患者空腹靜脈血，檢測HSCRP水平及其他生化、免疫學指標。3根據(jù)血清HSCRP水平進行分組A組HSCRP正常組03MGL；B組HSCRP輕度升高組310MGL；C組HSCRP明顯升高組10MGL。4分析三組患者在年齡、文化程度、病程及病情活動度、免疫學指標方面的差異，并比較三組患者之間的認知功能情況。5統(tǒng)計學方法①計量資料用均數(shù)±標準差X±S描述。②獨立樣本比率的比較用X2檢驗。③對多組正態(tài)分布資料應(yīng)用方差分析，偏峰分布資料應(yīng)用非參數(shù)檢驗。④對多因素采用偏相關(guān)分析及多重線性回歸分析。⑤檢驗水準以P005。5病情活動度血清HSCRP濃度水平與代表SLE的病情活動度的SLEDAI評分之間不存在相關(guān)關(guān)系R0019，P0859。結(jié)論16889％SLE女性患者有不同程度的認知功能障礙，主要表現(xiàn)在視空間與執(zhí)行功能、命名能力、注意力、記憶力及定向力方面。2血清HSCRP水平與SLE女性患者認知功能障礙之間存在負相關(guān)關(guān)系，可以作為評估SLE女性患者認識功能障礙出現(xiàn)的一項參考指標。3血清HSCRP水平與SLE女性患者血清中出現(xiàn)ANA、DSDNA、SM、SSA、SSB、RNP抗體、補體下降、血沉升高以及與SLE的病情活動無相關(guān)關(guān)系。

簡介：目的通過檢測SD大鼠認知功能損害模型血清中MMP9的表達及腦海馬區(qū)組織MMP9基因轉(zhuǎn)錄的改變情況；分析其對大鼠麻醉和手術(shù)后認知功能損害的影響，并探討認知功能損害模型中調(diào)控MMP9的表達信號通路。方法將SD大鼠水迷宮訓練6天后隨機分為3組，對照組A組15只、麻醉組B組35只和手術(shù)組C組35只。大鼠自實驗前一日禁食。A組腹部行布比卡因（濃度0125％，每只總量限30～50MG）浸潤麻醉。B組SD大鼠先行腹部布比卡因（濃度及用量同A組）浸潤麻醉后異氟醚基礎(chǔ)麻醉，再行氣管插管和機械通氣（1ML100G呼吸頻率為70110次MIN），濃度為2的異氟醚持續(xù)吸入麻醉2H。C組SD大鼠腹部先行布比卡因（濃度及用量同A組）浸潤麻醉，再行剖腹探查術(shù)，手術(shù)持續(xù)2H。分別在術(shù)前1D、術(shù)后1、3、5、7D利用翻轉(zhuǎn)的MRIS水迷宮實驗檢測其空間記憶和學習能力。測試完畢后分批處死大鼠，ELISA檢測不同時間段大鼠血清中MMP9表達的改變情況；提取大鼠腦海馬區(qū)組織總RNA，RTPCR檢測大鼠腦海馬區(qū)組織MMP9基因轉(zhuǎn)錄的改變情況；同時提取大鼠腦海馬區(qū)組織細胞核蛋白，WESTERNBLOT檢測海馬區(qū)組織細胞NFΚB的激活情況。結(jié)果MRIS水迷宮訓練后，測量大鼠游行到達平臺的時間和距離，與第1D比較，訓練后的大鼠每天游行時間和距離均縮短，差異具有統(tǒng)計學意義（P結(jié)論1麻醉與手術(shù)均可引起實驗鼠認知功能的損害，且手術(shù)較麻醉產(chǎn)生的不良影響更大；2麻醉與手術(shù)均可引起實驗鼠血清MMP9濃度增高與腦海馬區(qū)組織MMP9的高表達，與麻醉組大鼠比，手術(shù)組大鼠血清與腦海馬區(qū)MMP9的表達更強烈，持續(xù)時間更長；3NFΚB在大鼠認知功能損害的過程中可能發(fā)揮重要作用。

簡介：丙型肝炎病毒HCV所致的丙型肝炎HC是一種危害嚴重的傳染病，HCV感染呈世界性分布，在我國HCV感染者約有4000萬。為了控制HCV經(jīng)血液傳播，國家要求對獻血者進行抗HCV的檢測。目前國內(nèi)外HCV抗體檢測試劑均已開發(fā)了三代產(chǎn)品。第三代ELISA檢測試劑的質(zhì)量，較前兩代均有了很大提高，但還存在一定程度的漏檢和假陽性，如何提高HCV抗體試劑的質(zhì)量仍是一個亟待解決的問題。在ELISA方法上，目前抗HCV檢測試劑均采用間接法，即用酶免疫標記的抗人IGG為第二抗體，檢測血清中卜ICV抗體IGG。由于IGG抗體出現(xiàn)時間較晚，對早期感染易產(chǎn)生漏檢；同時，由于血清中非特異性物質(zhì)的吸附及類風濕因子等干擾，容易產(chǎn)生假陽性反應(yīng)；另外，ELISA試劑盒使用的許多基因工程表達抗原都有融合末端，其抗原性可影響抗體檢測，有時也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。而雙抗原夾心法ELISA使用的試劑從根本上更換了酶結(jié)合物質(zhì)，使得試劑對受檢樣品的特異性大大提高；同時，雙抗原夾心法ELISA檢測的是總抗體，除IGG之外，還可以檢測到IGM、IGA等。在感染早期，由于IGM抗體比IGG出現(xiàn)早，雙抗原夾心法就可以縮短檢測的窗口期，因而此種方法檢測的敏感性高。應(yīng)用雙抗原夾心ELISA法來代替間接ELISA法，可以大大提高診斷試劑的敏感性與特異性，此法己在乙肝表面抗體、梅毒抗體、HLV抗體等的檢測中得到了成功的應(yīng)用，但在抗HCV的檢測中目前還處于研究階段。我們采用HCV15基因型嵌合NS4抗原代替單一基因型的NS4抗原，以減少由于HCV基因變異對檢測可能造成的影響；用融合六個組氨酸的抗原來包被酶標板，用融合GST的抗原來作酶標抗原，以消除融合末端對檢測的影響。通過這些改進，本研究旨在建立一種敏感性高、特異性強的HCV雙抗原夾心ELISA檢測法，并初步探討其在HCV抗體檢測中的意義。本研究分為如下兩個部分一、HCV不同基因編碼區(qū)重組質(zhì)粒的構(gòu)建與重組抗原的表達和純化以能表達LITCVCE、NS3和NS4GST融合蛋白的三種重組質(zhì)粒CPGEX4T2、NS3PGEX4T2和NS4PGEX4T2為模板，分別構(gòu)建了能表達HCVCE、NS3和NS4HIS融合蛋白的另外三種重組表達質(zhì)粒CPET28AC、NS3PET28AC和NS4PET28AC；重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，各重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示，插入的片段大小及閱讀框架全部正確；從IPTG濃度、誘導表達時間與溫度三個方面對蛋白表達條件進行了優(yōu)化用NTANI柱純化融合六個組氨酸的HCV重組抗原HC、HNS3和HNS4，用GLUTATHIONESEPHAROSE柱子純化融合GST的重組抗原GC、GNS3和GNS4最后經(jīng)SDSPAGE鑒定，純化到的六種HCV重組抗原純度均較高，經(jīng)蛋白定量測定后濃度分別為HC為135MGML尿素變性；GC為0812MGML；HNS3為114MGML；GNS3為131MGML；HNS4為328MGML尿素變性；GNS4為162MGML。二、HCV抗原的HRP標記以及HCV抗體雙抗原夾心ELISA的建立與評價采用改良過碘酸鈉法，標記了三種HCV重組抗原GC、GNS3和GNS4。使用已知抗HCV陽性混合血清和陰性混合血清，從包被抗原、酶標記抗原二個方面進行方陣滴定，建立了單片段抗原夾心ELISA。方陣滴定結(jié)果顯示，抗HCV的C抗體檢測時，包被抗原HC的濃度為30ΜGML，酶標抗原GC稀釋度為13000；抗HCV的NS4抗體檢測時，包被抗原HNS4濃度為30ΜGML，酶標抗原GNS4稀釋度為11000；抗HCV的NS3抗體檢測時，包被抗原HNS3濃度為30ΜGML，酶標抗原GNS3稀釋度為11000。單片段夾心ELISA方陣滴定結(jié)果，可以得出的結(jié)論是酶標抗原GC的工作稀釋度分別是GNS3、GNS4的三倍，而GNS3、GNS4工作稀釋度相同。用己知抗HCV陽性混合血清和陰性混合血清LOOUL孔；抗原HC、HNS3、HNS4按摩爾比1105的比例混合用作包被抗原；標記后的抗原混合比例與包被抗原的混合比例相對應(yīng)，按1315根據(jù)單片段抗原夾心ELISA方陣滴定結(jié)果求得混合作第二抗原，重新方陣滴定，建立了雙抗原夾心ELISA。方陣滴定結(jié)果顯示，混合包被抗原工作濃度為50ΜGML，混合酶標抗原的工作稀釋度為1200。同時，分別從包被緩沖液、聚苯乙烯微孔板、封閉液、酶標抗原稀釋液、標本稀釋度等方面，優(yōu)化了實驗條件。用間接ELISA萬泰試劑與雙抗原夾心ELISA，同時檢測了收集自南京市第二人民醫(yī)院檢驗科的1968份血清標本，其中有17份血清標本在兩種檢測方法中檢測結(jié)果不相符，又用HCVRNA套式RTPCR檢測了這17份血清標本，發(fā)現(xiàn)14份間接法抗體陽性而雙抗原夾心法陰性的血清標本中只有1份標本的HCVRNA陽性，3份間接法陰性而夾心法陽性的血清標本中有2份標本的HCVRNA陽性。雙抗原夾心法與間接ELISA法總體符合率為991％；以兩種ELISA檢測抗HCV均陽性為HCV真陽性，而以兩種ELISA檢測抗HCV均陰性為真陰性，再結(jié)合套式RTPCR的結(jié)果，可以得出來自二院的這1968份血清標本中，HCV的感染率為98％193P1968；本實驗所建立的雙抗原夾心法ELISA與間接法ELISA北京萬泰的敏感性分別為994％和989％；特異性分別為999％和992％。此外，用套式RTPCR檢測了31份間接法與夾心ELISA法抗HCV均陽性的血清標本，發(fā)現(xiàn)有23份血清HCVRNA陽性，HCVRNA陽性率為742％2331，遠遠高于14份間接法抗體陽性而雙抗原夾心法陰性的血清標本的陽性率71％114。提示間接法檢測抗HCVIGG可能存在一定比例的假陽性。綜上所述，我們建立的檢測HCV抗體的雙抗原夾心法ELISA具有較高的敏感性和特異性，有望用于臨床HCV感染的診斷和獻血員的篩選。

簡介：山西醫(yī)科大學碩士學位論文慢病毒載體介導紅色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染人膀胱癌細胞的研究姓名宋濤申請學位級別碩士專業(yè)泌尿外科學指導教師楊曉峰20090501山西醫(yī)科大學七年制臨床醫(yī)學碩士專業(yè)學位論文THESTUDYOFTRANSFECTIONEXPERIMENTOFHUMANBLADDERCARCINOMACEL1MEDIATEDBYLENTIVIRALVECTORTAGGED‘T1RFPCARALNOMACEMECLLATECLDYENTLVLRAVECTORTAGGEDW111TGENEABSTRACTOBJECTIVETOSTUDYTHEPOSSIBILITYOFTHEREDFLUORESCENTPROTEINRFPGENEACTSASREPORTERGENEINLIVECELLS，WESPECIALLYCONSTRUCTTHERECOMBINATIONTHREEPLASMIDLENTIVIRALVECTORSTAGGEDWITHRFP，ANDTRANSFECTTHEHUMANBLADDERCARCINOMMERCELLBCC，T一24CELL1INEOBSERVETHERESULTAFTERTHETRANSFECTIONACCOMPLISHEDUNDERTHECONFOCALLASERFLUORESECENCEMICROSCOPYMETHODTOTRANSFECTTHE293TCEL1WITHTHEVIRALPACKAGINGCEL1BYUSINGTHERFPLENTIVIRUSRECOMBINATIONLVCMVRFPANDBOTHPHELPER10ANDPHELPER20VECTORSACCORDINGTOTHELIPOFECTAMINE2000METHODAFTERINCUBATINGTHEMFOR34DAYS，HARVESTANDREFINETHEVIRUSSOLUTIONFETCHTHESOLUTION，INGATHERANDCONCENTRATETHEVIRUSSOLUTIONPACKAGESOMEOFTHEMATTHETEMPERATUREOF一80℃FORLONGTERMSAVINGTHELEFTSOLUTIONWASLEFTFORTHETITERTESTBYTHEREALTIMEWAYORHOLEDILUTIONWAYCULTURETHET24CELL1INEIN96WELLPLATESANDVIRUSOFSPECIFICCONCENTRATIONINTHEAIRINCUBATORINDIFFERENTMOIPROPORTIONFOR72’96HOURSTOGROPETHEBESTCONDITIONFORTRANSFECTINGTRANSFECTTHETARGETCELLREPEATLYACCORDINGTHERESULTOFTHEPRETESTABOVEOBSERVETHECEL1SUNDERTHECONFOCALLASERF1UORESECENCEMICROSCOPYWITHTHE558NMEXCITINGWAVELENGTHAND583NMEMITINGWAVELENGTHIDENTIFYINGTHEEXPRESSIONOFRFPGENEANDTRANSFECTIONEFFICIENCYBYFLOWCYTOMETRYAFTERTHATCOCULTURETHET一24CELLANDTRANSFECTEDT一24CEL1TOOBSERVETHEIRGROWINGPROPERTYRESULTSUCCESSFULLYCONSTRUCTINGTHERECOMBINATIONOFTHREEPLASMIDLENTIVIRALVECTORSTAGGEDWITHRFPAFTERTRANSFECTINGTHECARCINOMACELL1INE，THECELL1INESTRONGLYEMITTHEREDFLUORESCENCEUNDERTHECONFOCALLASERF1UORESECENCEMICROSCOPYCONCLUSIONDSREDGENECANSUCCESSFULLYEXPRESSINT一24CELLINFORMOFTHREEPLASMIDLENTIVIRALVECTORS，SOTHELIVECARCINOMACELLSCANBEDIREDTLYVISUALIZEDBYTHECONFOCALLASERF1UORESECENCEMICROSCOPYVIATHEREDFLUORESECENTOFTRANSFECTEDCELLSTHEMSELVESITISSUGGESTEDTHATDSREDGENEBEAFAVOURABLEREPTORGENEANDSCREENINGMARKERIN1IVECELLSKEYWORDSREDFLUORESCENTPROTEINGENERECOMBINATIONTHREE。PLASMIDLENTIVIRAL2

簡介：流行性感冒是由流感病毒引起的發(fā)病率高，流行廣泛，傳播迅速的急性病毒性呼吸道疾病，因此抗流感病毒藥物的研究受到普遍的重視，現(xiàn)在廣泛使用的金剛烷胺、病毒唑等藥物毒副作用明顯，中醫(yī)藥及復方研究在防治流感方面表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，有著廣闊的前景。本實驗就板藍根提取液AA和A抗流感病毒作用作了初步的研究。藥物是由兩種與以往不同的工藝提取的，從雞胚實驗和動物實驗兩方面研究藥物抗流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1和增強免疫功能方面的作用。板藍根提取液AA雞胚實驗先將藥物與病毒在體外作用1H后，再注射入雞胚。35℃培養(yǎng)3天后，收獲雞胚尿囊液，檢測尿囊液的血凝效價。板藍根提取液AA的動物實驗1藥物的抗病毒作用ICR小鼠70只，分為7組，每組10只，先提前灌胃給藥3天，灌胃劑量04ML只，3天后除藥物對照組外，各組小鼠在乙醚輕度麻醉下滴鼻給予病毒和生理鹽水，50ΜL只。連續(xù)給藥8天，觀察14天小鼠的死亡情況。2藥物的抗炎作用小鼠的給藥染毒方法同上。染毒第9天無菌解剖小鼠，取肺，做肺病理切片。3藥物對機體的免疫功能影響小鼠的給藥染毒方法同上，染毒第9天無菌解剖小鼠，取脾，同時做T、B淋巴細胞增殖試驗。每組的小鼠留取血清用ELISA方法檢測細胞因子TNFΑ、IFNΓ、IL2。板藍根提取液A的實驗方法同AA。雞胚實驗結(jié)果顯示，板藍根提取液AA和A能滅活流感病毒鼠肺適應(yīng)株FML。動物實驗顯示1經(jīng)板藍根提取液AA和A治療后的小鼠死亡率明顯降低，尤其是板藍根提取液AA和A的中、低劑量組的動物死亡情況明顯好于病毒對照組；2由肺指數(shù)和病理切片分析得出板藍根提取液AA中劑量組和A低劑量組肺臟病變明顯減輕，抗炎作用較好；3由脾指數(shù)和T、B淋巴細胞增殖試驗分析得出板藍根提取液AA和A的中、低劑量組能促進免疫細胞的增殖，增強小鼠的免疫功能。4細胞因子檢測結(jié)果顯示小鼠致肺炎過程中，經(jīng)板藍根提取液治療后的小鼠血清中IFNΓ，IL2含量較病毒對照組高P005；TNFΑ含量較病毒對照組低P005。說明藥物具有一定的增強鼠免疫功能的作用。綜上所述板藍根提取液AA和A在體外能滅活病毒，在體內(nèi)具有一定的抗流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1、抗炎和增強鼠免疫功能的作用，尤其是板藍根提取液AA和A的中、低劑量的作用更加明顯。板藍根提取液AA和A雖然由兩種不同的工藝提取的，但兩者抗病毒和增強鼠免疫功能的作用差別不大。

簡介：天津醫(yī)科大學碩士學位論文內(nèi)觀認知療法對抑郁癥患者認知偏差干預研究姓名侯筱菲申請學位級別碩士專業(yè)臨床醫(yī)學；精神病與精神衛(wèi)生學指導教師毛富強201205天津醫(yī)科大學碩士學位論文持性心理治療。④受教育程度越低的抑郁癥患者越常產(chǎn)生自動式思維。⑤內(nèi)觀認知療法糾正抑郁癥患者歪曲認知的療效與其受教育程度有關(guān)。⑥抑郁癥患者元認知、自動式思維、認知偏差均與其抑郁程度相關(guān)。⑦內(nèi)觀認知療法糾正患者認知偏差的療效與其治療前抑郁程度相關(guān)。關(guān)鍵詞抑郁癥內(nèi)觀認知療法元認知自動思維認知偏差

簡介：本研究基金來源1中華兒科雜志第二屆雙鶴珂立蘇科研基金編號CJP0092四川省教育廳科研項目基金編號08ZAISO一0333四川省衛(wèi)生廳科研基金編號1103404瀘州市科技局瀘州市政府瀘州醫(yī)學院聯(lián)合專項資金編號2013LZLYJ08PINLSHRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其對高氧誘導人肺泡上皮細胞凋亡的影響摘要目的PINL是人類肽基脯氨酰異構(gòu)酶，現(xiàn)在主要用于研究抑制腫瘤細胞的靶點。而目前研究發(fā)現(xiàn)，PINL參與氧化應(yīng)激通路，抑制其表達將可能減少高氧肺損傷，但具體作用機制研究鮮有報道。RNAI技術(shù)是目前公認能夠快速有效的基因沉默方式，其可高效、特異性下調(diào)目標基因的表達，研究基因功能和信號轉(zhuǎn)導途徑，越來越受到人們的關(guān)注。本實驗擬構(gòu)建PINLSHRNA慢病毒載體，建立穩(wěn)定抑制肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶PINL表達的A549細胞系，從而探討PINL在氧化應(yīng)激通路介導高氧誘導人肺泡II型上皮A549細胞凋亡的影響，抑制其表達后是否對高氧誘導肺泡上皮細胞的保護作用。方法根據(jù)查閱文獻獲得PINLSHRNA干擾靶點序列并插入PLENRGPH載體，構(gòu)建PLENRGPHPINLSHRNA慢病毒載體，隨后轉(zhuǎn)入人胚腎HEK293T細胞中，收集其上清進行病毒滴度測定，再行慢病毒的包裝，將獲得的慢病毒毒液感染A549。通過實時定量PCRQRTPCR及WESTERNBLOT法檢測PINL在不同組的表達抑制情況，最終獲得穩(wěn)定抑制PINL表達的A549PINLSHRNA細胞系。隨后將實驗分為四組空氣組、高氧組、空載體組以及A549PINLSHRNA高氧組。高氧組、A549PINLSHRNA高氧組及空載體組均以高體積分數(shù)氧高氧誘導細胞，即通入3L／MIN的90％氧氣和5％二氧化碳高純混合氣LOMIN，并在培養(yǎng)箱中密培養(yǎng)24H?？諝饨M則是含有10％胎牛血清和1％青鏈霉素的1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后收

簡介：研究背景乙型肝炎病毒感染是全球范圍內(nèi)影響人類健康的重大問題，我國是乙型肝炎高流行地區(qū)，全國一般人群HBSAG陽性率為909％，估計約12億人為慢性HBV感染，占全世界慢性HBV感染人數(shù)的131。目前人們對HBV及其所致疾病有了相當深入的認識，但由于缺乏合適的動物模型及體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，乙型肝炎病毒的生物學研究和治療進展緩慢26?，F(xiàn)有用于研究HBV的細胞模型主要是人原代肝細胞和肝癌細胞系，前者保留了分化肝細胞的重要細胞學特性，但其缺陷在于在體外培養(yǎng)幾天后開始出現(xiàn)肝細胞特殊形態(tài)的消失，并且失去了對HBV的感染和復制能力，因而限制了其應(yīng)用；而后者是通過轉(zhuǎn)染HBV基因組或添加化學試劑而非HBV自然感染的方式進入到細胞中，因此不能用于HBV早期感染過程的研究。為此，本研究旨在通過將經(jīng)化學誘變劑誘導產(chǎn)生次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶HGPRT基因突變的HEPG2細胞與未攜帶HBV的人原代肝細胞融合建立一新型細胞系，使其能夠自然感染HBV并能體外傳代培養(yǎng)，為HBV感染宿主細胞的早期機制的研究，以及病毒侵入人肝細胞后完整的復制過程的研究提供一個強有力的工具。目的建立一新型細胞株，使該細胞株既能自然感染HBV又能傳代培養(yǎng)，評價雜交細胞對HBV的自然感染能力。方法分離培養(yǎng)未攜帶HBV的人原代肝細胞，與誘導突變的HEPG2細胞進行融合得雜交細胞，經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選，利用胰蛋白酶G顯帶技術(shù)鑒定所得細胞，用含HBV的慢性乙型肝炎患者血清感染雜交細胞（同時感染HEPG2作為對照），巢式PCR檢測感染后細胞內(nèi)HBVDNA合成及分泌情況及有無HBV復制中間產(chǎn)物HBVCCCDNA，間接免疫熒光檢測感染后細胞內(nèi)HBCAG的表達，電化學發(fā)光法檢測感染后細胞培養(yǎng)上清中的HBSAG和HBEAG。結(jié)果成功建立人原代肝細胞與HEPG2的雜交細胞，能體外傳代培養(yǎng)，染色體核型分析示雜交細胞染色體眾數(shù)為99條，證實為融合細胞，HBV感染后第4天起，雜交細胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中均能檢測到HBVDNA，HBV感染后第3天起，雜交細胞內(nèi)可以檢測到HBV的復制中間產(chǎn)物HBVCCCDNA，HBV感染后第4天起，雜交細胞胞漿及部分胞核內(nèi)HBCAG始終是陽性表達，間接免疫熒光染色呈胞漿彌漫性著色，電化學發(fā)光法檢測培養(yǎng)上清中HBSAG及HBEAG持續(xù)表達；而感染后的HEPG2細胞檢測結(jié)果均為陰性。結(jié)論成功建立了一個兼具有人原代肝細胞和HEPG2細胞遺傳特性的雜交細胞株，該雜交細胞株可以被慢性乙型肝炎患者血清中的HBV病毒自然感染，并能傳代培養(yǎng)，可以進一步用作研究HBV感染的體外細胞模型。

簡介：南方醫(yī)科大學2011級碩士學位論文深圳地區(qū)獻血人群隱匿性乙型肝炎病毒感染特征分析CHARACTERIZATIONOFOCCULTHEPATITISBVIRUSINFECTIONINSHENZHENBLOODDONORS課題來源國家自然科學基金81071348和81371801學位申請導師姓專業(yè)名培養(yǎng)類培養(yǎng)層所在學人杜鵬名黎誠耀教授稱免疫學型學術(shù)型次碩士研究生院生物技術(shù)學院答辯委員會主席江麗芳教授答辯委員會委員江振友教授付涌水教授張桂紅教授張雁教授2014年3月14日廣州摘要最廣，我國北方地區(qū)以C基因型為優(yōu)勢株，南方地區(qū)B型最常見。OBI的發(fā)生與發(fā)展機制現(xiàn)在仍然不清楚，可能機制包括一HBSAG和抗HBS結(jié)合形成了免疫復合物；二變異體的形成影響了HBSAG編碼區(qū)S基因?qū)Α癆，’抗原決定簇的編碼；三與其它肝炎病毒合并感染可能影響了HBV的復制，減少了HBSAG的合成。HBSAG的檢測作為我國HBV檢測的唯一指標，核酸檢沏LJNUCLEICACIDTEST，NAIT還沒有納入法定項目，輸血存在HBV窗口期感染和OBI感染的輸血殘余風險，國內(nèi)對B、C型OBI的研究停留在起步階段，沒有詳細的OBI流行病學調(diào)查，關(guān)于B、C型OBI的分子生物學特性的分析也只有零星的報道，沒有進行進一步詳盡的研究，本課題對我國B、C型OBL分子生物學的研究具有重要意義1，調(diào)查我國深圳地區(qū)OBI的流行情況；2，探討我國B、C型OBI的分子生物學特征；3，為OBI基因型B和C的監(jiān)測與防控策略提供重要依據(jù)，改進血液安全篩查方法；4，為OBI的臨床發(fā)生、發(fā)展和個性化治療方案提供理論指導。材料2010年4月2012年12月深圳市血液中心采集的310，167份無償獻血者標本，其中初次獻血者114，761份，占37％，重復獻血者195，406份，占63％，所有標本經(jīng)過表面抗原膠體金試紙與ALT羅氏干式生化分析儀初篩，然后進行酶免法EIA法和多聯(lián)病毒核酸篩查技術(shù)檢測。方法1無償獻血者樣本經(jīng)進口和國產(chǎn)兩種試劑進行HBSAG的檢測，經(jīng)美國諾華公司的TIGRIS全自動血液核酸檢測儀進行三聯(lián)熒光病毒單人份檢測，使用化學發(fā)光法CMIA，雅培進行HBSAG的確認。2用QPCR方法進行HBSAG／DNA樣本HBV病毒載量的測定。3對HBSAG／DNA樣本進行基本核心啟動子／前C區(qū)BCP／PC、HBV全基因、PRES／S區(qū)、S區(qū)、PREC／C區(qū)的巢式PCR的擴增，PCR產(chǎn)物送公司測序。4從GENEBANK基因數(shù)據(jù)庫挑選我國B型和C型HBV野毒株作為OBI變異株的參考序列；使用MEGA軟件分析OBI的S區(qū)序列以確定基因型。5將OBI樣本全基因序列分為PRE。S／S、POL、X、PREC／C，每個區(qū)核苷酸翻譯成蛋白序列后和相應(yīng)基因型的野毒株進行序列比對分析。6與野毒株基因序列比對，分析OBI毒株全基因序列調(diào)控元件變