PKC誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白外翻誘發(fā)的巨噬細(xì)胞噬紅細(xì)胞作用.pdf

1、人紅細(xì)胞的平均壽命為100~120天，正常人體內(nèi)大約存在3×1013個(gè)紅細(xì)胞。每天，有超過(guò)2×1011個(gè)紅細(xì)胞被替換。紅細(xì)胞在體內(nèi)經(jīng)歷成熟、衰老，最終被脾、肝、骨髓等處的巨噬細(xì)胞吞噬、分解。而且老化或者疾病的紅細(xì)胞往往呈現(xiàn)較弱的細(xì)胞形變以及形變恢復(fù)能力，使之易于被脾臟滯留，從而被吞噬細(xì)胞吞噬以及消化。巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的識(shí)別主要通過(guò)其表面的受體來(lái)進(jìn)行的。成熟哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核以及細(xì)胞器等，紅細(xì)胞膜的異常（如帶3蛋白交聯(lián)，錨蛋白外

2、翻）觸發(fā)了巨噬細(xì)胞表面的受體分子與其識(shí)別，接著黏附、吞噬和分解。然而，膜蛋白的異常導(dǎo)致的紅細(xì)胞過(guò)早清除或者凋亡障礙與多種血液疾病相關(guān)，如膜蛋白缺陷、阿爾茨海默癥以及高原紅細(xì)胞增多癥。同樣在血液保存中，膜蛋白的異常與否往往與血液保存時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)。探其根源，紅細(xì)胞膜蛋白的異常以及紅細(xì)胞程序性死亡與紅細(xì)胞胞內(nèi)的PKC激活密切相關(guān)。因此，本文通過(guò)PMA激活紅細(xì)胞胞內(nèi)的PKC，從而探討激活的PKC與紅細(xì)胞錨蛋白外翻的關(guān)系以及誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白外翻

3、的機(jī)制問(wèn)題，也進(jìn)一步探索了激活的PKC誘導(dǎo)紅細(xì)胞膜骨架結(jié)合親和力的變化與紅細(xì)胞形變能力的相關(guān)關(guān)系。希望為深入了解紅細(xì)胞膜蛋白的結(jié)構(gòu)以及治療膜蛋白異常的相關(guān)血液疾病，同時(shí)也對(duì)研究人工紅細(xì)胞的膜骨架蛋白與紅細(xì)胞變形性能、血液保存過(guò)程中血液保存時(shí)間的延長(zhǎng)等提供細(xì)胞和分子層面的探索機(jī)理。
　　紅細(xì)胞錨蛋白為膜內(nèi)在蛋白，只有當(dāng)錨蛋白外翻到細(xì)胞膜的外側(cè)且錨蛋白R(shí)GD序列端也暴露在細(xì)胞表面時(shí)，巨噬細(xì)胞表面的受體分子整合素αvβ3才能與之識(shí)別、黏

4、附和吞噬。本研究論文通過(guò)PMA激活紅細(xì)胞胞內(nèi)的PKC來(lái)判斷與紅細(xì)胞程序性死亡緊密相關(guān)的胞內(nèi)PKC的激活能否誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白的外翻。結(jié)果表明，激活的PKC能夠誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白外翻到紅細(xì)胞膜外側(cè)，然而錨蛋白外翻的紅細(xì)胞的比例呈PMA濃度依賴關(guān)系，而且錨蛋白外翻的紅細(xì)胞的比例體現(xiàn)出血液捐獻(xiàn)者的個(gè)體差異性。這意味著盡管PMA誘導(dǎo)PKC的激活能夠促使紅細(xì)胞錨蛋白的外翻，但是錨蛋白外翻的紅細(xì)胞的比例與胞內(nèi)游離的PKC對(duì)PMA的敏感性以及紅細(xì)胞胞內(nèi)P

5、KC活性的異質(zhì)性有關(guān)。為了探討外翻的錨蛋白與整合素αvβ3的結(jié)合能否介導(dǎo)巨噬細(xì)胞與紅細(xì)胞的黏附，本文通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞黏附紅細(xì)胞的檢測(cè)以及封閉整合素αvβ3（封閉膜上的結(jié)合位點(diǎn)）和錨蛋白（封閉巨噬細(xì)胞表面的結(jié)合位點(diǎn)）的結(jié)合位點(diǎn)分析。結(jié)果表明，錨蛋白的外翻能誘發(fā)巨噬細(xì)胞的噬紅細(xì)胞作用，結(jié)合位點(diǎn)的封閉能明顯降低巨噬細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞的黏附數(shù)量。
　　紅細(xì)胞程序性死亡往往起始于細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。提高的胞內(nèi)鈣離子濃度能夠激活半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶

6、以及鈣依賴的酶，從而降解細(xì)胞骨架及分解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞囊泡化等，最終細(xì)胞調(diào)亡。PKC是一種鈣離子依賴的酶，激活的PKC能夠誘導(dǎo)細(xì)胞胞外鈣離子的快速流入，促使其胞內(nèi)鈣離子水平的升高。同時(shí)激活的PKC也能誘導(dǎo)紅細(xì)胞膜蛋白的磷酸化，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞膜骨架結(jié)合親和力的減弱。因此，本文運(yùn)用PKC的抑制劑Calphostin C（封閉PKC的激活位點(diǎn)）和Chelerythrine chloride（競(jìng)爭(zhēng)性抑制激活的PKC的磷酸化作用位點(diǎn)）來(lái)分析鈣離子

7、以及錨蛋白的磷酸化與紅細(xì)胞錨蛋白外翻的關(guān)系。結(jié)果表明，激活的PKC誘導(dǎo)細(xì)胞胞外鈣離子的流入以及錨蛋白的磷酸化作用共同促使紅細(xì)胞錨蛋白的外翻。此外，研究也表明僅僅是胞內(nèi)鈣離子水平的增加或者僅僅錨蛋白的磷酸化作用均不足以誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白的外翻。
　　為了進(jìn)一步探討激活的PKC與紅細(xì)胞錨蛋白外翻的關(guān)系。本文通過(guò)不連續(xù)密度梯度離心法分離出老紅的紅細(xì)胞層，檢測(cè)其錨蛋白外翻、胞內(nèi)鈣離子以及錨蛋白磷酸化水平的情況。也檢測(cè)了PMA誘導(dǎo)不同密度層紅

8、細(xì)胞的上述指標(biāo)變化情況。結(jié)果表明，在老化層中有一定數(shù)目的紅細(xì)胞呈現(xiàn)其錨蛋白的外翻。同時(shí)PMA對(duì)不同密度層紅細(xì)胞的錨蛋白外翻以及胞內(nèi)鈣離子有不同的影響（對(duì)不同密度層紅細(xì)胞錨蛋白的磷酸化水平影響卻不大）。這意味著在老化的紅細(xì)胞中存在著紅細(xì)胞程序性死亡的信號(hào)分子—錨蛋白外翻，同時(shí)也進(jìn)一步確認(rèn)了誘發(fā)紅細(xì)胞錨蛋白外翻的兩個(gè)必不可必少的條件（胞內(nèi)鈣離子水平的增加以及紅細(xì)胞錨蛋白的磷酸化作用）。
　　本論文還檢測(cè)了PKC誘導(dǎo)的錨蛋白外翻對(duì)紅細(xì)胞

9、變形性能的影響，以及PKC誘導(dǎo)的膜蛋白磷酸化作用導(dǎo)致膜骨架結(jié)合親和力的改變與紅細(xì)胞形變能力的變化關(guān)系。結(jié)果顯示，錨蛋白的外翻能夠引起紅細(xì)胞變形性能的減弱，錨蛋白的磷酸化作用引起的紅細(xì)胞膜骨架結(jié)合親和力的改變與紅細(xì)胞變形指數(shù)的變化關(guān)系不大，而蛋白4.1的磷酸化作用誘導(dǎo)的紅細(xì)胞膜骨架結(jié)合親和力的改變?cè)诩t細(xì)胞形變能力的變化關(guān)系中有著重要的作用。因此，錨蛋白的外翻以及膜骨架結(jié)合親和力的減少誘導(dǎo)的紅細(xì)胞形變能力的減弱進(jìn)一步促進(jìn)了巨噬細(xì)胞對(duì)該紅細(xì)胞