33 115例體檢者AMA-M2篩查及NF-κB信號(hào)通路與PBC發(fā)病機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分33115例體檢者抗M2型線(xiàn)粒體抗體篩查的結(jié)果分析
　　目的：了解體檢人群中原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)患病率及潛在患病風(fēng)險(xiǎn)。
　　方法：對(duì)33115名體檢者檢測(cè)血清抗線(xiàn)粒體抗體M2亞型(AMA-M2)及肝功能，統(tǒng)計(jì)分析PBC的患病率、患病特點(diǎn)、好發(fā)人群、危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)果：篩查出349例抗M2型線(xiàn)粒體抗體陽(yáng)性，確診PBC36例，患病率為108.71/105；其中男性9例，女性27例，患病率分別為53.21/

2、105、166.66/105，女性高于男性(P＜0.01)。36例PBC患者平均發(fā)病年齡(57.00±14.05)歲。年齡分組≤40歲組、41~60歲組與≥61歲組患病率分別為18.79/105、131.00/105和440.14/105，各年齡組患病率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；≤40歲年齡組患病率低于其余兩組(P＜0.01)，≥61歲組患病率最高(P＜0.01)。確診PBC患者堿性磷酸酶(ALP)均顯著升高(223.01±

3、160.67) U/L；其中9例患者 ALT輕至中度升高(57.00±9.81)U/L，4例 ALT升高至100 U/L以上(177.00±59.76)U/L；12例直接膽紅素(DBil)升高(16.82±14.66)umol/L；未見(jiàn)肝內(nèi)膽管梗阻的影像學(xué)表現(xiàn)。結(jié)合臨床資料，部分確診患者有抽煙、飲酒史、陰道及腸道感染史、口服激素類(lèi)藥物的用藥史等PBC相關(guān)患病風(fēng)險(xiǎn)因素存在。313例單純AMA-M2陽(yáng)性者，這部分體檢者只有AMA-M2陽(yáng)性，

4、沒(méi)有ALP異常及PBC相關(guān)臨床癥狀出現(xiàn)。
　　結(jié)論：PBC在體檢人群中的患病率并不罕見(jiàn)，運(yùn)用高敏感度的檢測(cè)方法是篩查PBC關(guān)鍵；單純AMA-M2抗體陽(yáng)性者，其中一部分可能是PBC的早期患者，應(yīng)當(dāng)做好疾病隨訪密切關(guān)注疾病進(jìn)展。
　　第二部分 NF-κB信號(hào)通路與原發(fā)性膽汁性肝硬化發(fā)病機(jī)制的初步研究
　　目的：通過(guò)檢測(cè)IL-18刺激CD4+T細(xì)胞體外增殖情況及NF-κB信號(hào)通路的激活狀態(tài)，初步探討NF-κB信號(hào)通路在PBC

5、發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法：分別收集30例健康體檢者、30例單純AMA-M2陽(yáng)性者和31例PBC患者外周血，采用密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，磁珠分離法分選出CD4+T細(xì)胞。對(duì)分選后的細(xì)胞運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選純度并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。運(yùn)用CCK-8檢測(cè)IL-18對(duì)CD4+T細(xì)胞的體外增殖作用，根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化選取細(xì)胞增殖最佳條件，比較各研究組經(jīng)IL-18刺激后的細(xì)胞增殖率。從各研究組中分選出的CD4+T

6、細(xì)胞經(jīng)IL-18刺激后，收集細(xì)胞分別提取胞質(zhì)蛋白及胞核蛋白，運(yùn)用Western blot分別檢測(cè)刺激前及刺激后胞質(zhì)蛋白IκBα和胞核蛋白NF-κB p65的蛋白表達(dá)，比較各研究組經(jīng)IL-18刺激后IκBα和NF-κB p65蛋白表達(dá)量的下調(diào)率及上調(diào)率，了解NF-κB信號(hào)通路在各研究組中的激活狀態(tài)。同時(shí)分析PBC患者組肝功能指標(biāo)異常特點(diǎn)。
　　結(jié)果：1、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞分選純度在90％以上，細(xì)胞濾過(guò)液中CD4+T細(xì)胞約0

7、.1%，分選完全并且效率高。2、外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)及CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：PBC組CD4+T細(xì)胞(0.859±0.154)×106/ml顯著高于正常組與單純AMA-M2陽(yáng)性組(0.569±0.101)×106/ml、(0.546±0.127)×106/ml(P＜0.01)；以細(xì)胞數(shù)量105/孔接種、加入CCK-8試劑后孵育4h是CD4+T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的最適條件；經(jīng)IL-18刺激后各研究組CD4+T細(xì)胞均可被刺激增殖，并且PBC組

8、增殖率(23.85%)高于其余兩組(11.75%、12.98%)(P＜0.01)。3、Western blot：未給予IL-18刺激前，與其余兩組相比、PBC組IκBα蛋白表達(dá)量最低(P＜0.01)，NF-κB p65蛋白表達(dá)量最高(P＜0.01)；給予IL-18刺激后，IκBα蛋白表達(dá)下調(diào)率分別為正常組15.25%、單純AMA-M2陽(yáng)性組13.37%、PBC組34.37%，三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；正常組與單純AMA-

9、M2陽(yáng)性組相比下調(diào)率無(wú)差異(P＞0.05)；PBC組下調(diào)率高于其余兩組(P＜0.01)；經(jīng)IL-18刺激后，各組NF-κB p65蛋白表達(dá)量上調(diào)率分別為23.91%、20.77%、61.35%，三組之間有差異(P＜0.01)，正常組及單純AMA-M2陽(yáng)性組相比上調(diào)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；PBC組NF-κB p65蛋白表達(dá)上調(diào)率高于其余兩組(P＜0.01)。4、對(duì)PBC組肝功能生化指標(biāo)結(jié)果進(jìn)行分析：肝功能異常主要是ALP和γ-GT