密碼子優(yōu)化的人生長素基因在大腸桿菌及人生長素基因在畢赤酵母中表達的研究.pdf

1、人生長激素(hGH)是由人的腦垂體前葉合成分泌的一種非糖化蛋白類激素，在人體生長發(fā)育方面起著極其重要的作用。人生長激素的主要生理功能是促進人體生長發(fā)育和維持組織器官的正常功能，如果缺乏就會產(chǎn)生侏儒癥及組織器官的萎縮和功能衰竭。除此之外，人生長激素還可用于燒傷、骨折、創(chuàng)傷、出血性潰瘍、組織壞死、肌肉萎縮、骨質(zhì)疏松以及過渡肥胖等疾病的輔助治療。為了提高hGH在大腸桿菌中的表達量，在不改變氨基酸序列的前提下，對編碼hGH的序列進行了密碼子優(yōu)化

2、，構(gòu)建了原核重組表達載體，以期能夠降低成本。同時，由于畢赤酵母表達系統(tǒng)在重組蛋白表達方面的許多優(yōu)點，研究了目的基因在畢赤酵母中的表達情況，建立了畢赤酵母表達系統(tǒng)的平臺，為工業(yè)化的生產(chǎn)奠定了基礎。 本論文的主要內(nèi)容有三個部分： 1.密碼子優(yōu)化的人生長素基因的全基因合成及克隆。 2.密碼子優(yōu)化的人生長素基因在大腸桿菌中的表達。 3.人生長素基因在畢赤酵母中的分泌表達。 結(jié)果及結(jié)論如下：

3、 1.根據(jù)人生長素基因的氨基酸序列，選擇大腸桿菌所偏好的密碼子，人工設計并合成了20個寡核苷酸片斷。通過重疊區(qū)擴增法，利用PCR成功地合成了人生長激素基因的全序列。經(jīng)克隆測序，證明我們已成功地實現(xiàn)了人生長素基因的合成及克隆。 2.T克隆測序正確后，利用NdeⅠ及BamHⅠ分別雙酶切表達載體pET-22b和目的片斷，構(gòu)建pET-hGH*表達載體，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達菌，IPTG誘導，提取周質(zhì)蛋白，SDS-PAGE、放射

4、免疫鑒定蛋白的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白表達量不僅沒有得到提高，反而表達量非常低甚至是不表達，優(yōu)化各種表達條件，蛋白表達量均沒有得到提高。于是換用pINIII-ompA3表達載體，同時對5'密碼子進行了替換，重新構(gòu)建了pINIII-ompA-hGH*表達載體，轉(zhuǎn)化BL(21)表達菌，37℃發(fā)酵15h，經(jīng)SDS-PAGE及放射免疫測定，蛋白表達量得到了很大提高，BandScan凝膠掃描軟件分析目的蛋白約占總蛋白的25％左右，放射免疫測定蛋白表

5、達量約為18mg/L左右。因此可以初步得出結(jié)論：密碼子設計需要進一步優(yōu)化。同時，密碼子優(yōu)化只是影響蛋白表達量的一個因素，質(zhì)粒拷貝數(shù)、基因二級結(jié)構(gòu)、蛋白穩(wěn)定性、翻譯效率、培養(yǎng)條件以及蛋白表達載體的選擇等都與蛋白表達水平有關(guān)。 3.用PCR技術(shù)從質(zhì)粒pCDNA3.0/hGH擴增得到hGH基因。將其插入含有AOX1啟動子和α分泌信號肽序列的畢赤酵母表達載體pPIC9K中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K/hGH，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，篩選